产品名称：RT-PCR Kit (With gDNase) 第一链合成试剂盒(去基因组)
产品编号：BLGE169
产品规格：
| 产品组成 |
BLGE169-01 (25rxn) |
BLGE169-02 (100rxn) |
BLGE169-03 (500rxn) |
| 5×gDNA Buffer | 50μl | 200μl | 5×BLGE169-02 |
| RT Primer Mix | 50μl | 200μl | |
| RT Enzyme Mix | 25μl | 100μl | |
| 10× RT Buffer | 50μl | 200μl | |
| RNase Free ddH2O | 1ml | 2×1ml |
 |
说明书 |
产品情况：RT-PCR Kit(With gDNase)第一链合成试剂盒包含了最新开发的逆转录酶和缓冲系统，可在提高cDNA合成效率的同时，快速去除基因组中DNA污染，以保证后续定量结果的稳定、可靠。本品广泛适用于动物、植物及微生物RNA的逆转录反应，反应产物可兼容染料法和探针法qPCR、cDNA文库构建、SAGE（基因表达连续分析）、引物延伸等多种实验方案，产品特色如下：
1.逆转录效率高达95%以上；
2.gDNase组分可在42℃ 3min内去除gDNA，可避免Total RNA中基因组DNA的干扰；
3.RT Enzyme增加了疏水motif，具有更强的RNA亲和力和热稳定性，可在42℃ 15min完成cDNA第一链的合成；
4.通读常规与复杂模板，快速解读GC含量高、二级结构复杂的RNA模板；
5.对不同物种来源及杂质较多的RNA模板适用性高，可配合荧光定量检测产品提高灵敏度和稳定性。
储存运输：本品需使用干冰运输，-40~-20℃可保存一年。
注意事项：
（一）高质量的RNA对于制备cDNA至关重要，实验前请用电泳验证RNA的完整性；实验全程请在冰上操作，以防RNA降解。
（二）对于二级结构很复杂的RNA模板，推荐使用变性步骤（模板RNA 65℃孵育5min，继而转移至冰上待下一步操作）。
（三）PCR反应有非特异性扩增时，可将逆转录温度升到50℃。
（四）根据实验需求可选用Oligo-dT Primer或Gene Specific Primer，引物使用量可选用Oligo-dT Primer 50pmol/20μl反应体系，Gene Specific Primer 5pmol/20μl反应体系。
（五）下列操作步骤适用于模板量为总RNA≤2μg，如大于2μg请按比例扩大反应体系。
实验流程：
（一）自备产品
RNase-free 1.5ml离心管、0.2ml PCR管、移液器及吸头、PCR仪、冰或移动冰盒
（二）实验准备
1.设定模板50ng-2μg总RNA的20μl反应体系；
2.冰上解冻模板RNA；
3. 5×gDNA Buffer、RT Primer Mix、10×RT Buffer、RNase-Free ddH2O室温解冻后，迅速置于冰上；
4.使用前将每种溶液振荡混匀，并可快速离心收集液体；
注意：请于冰上完成以下实验步骤，并为保证反应液配制的准确性，建议先配制成Mix，然后再分装到每个反应管中。
（三）去除基因组DNA
1.在RNase-free 1.5ml离心管中配制以下溶液A：
| 5×gDNA Buffer | 2μl |
| 模板RNA | Total RNA: 1pg ~1µg |
| RNase-Free ddH2O | 补足到10μl |
（四）逆转录体系配制
1.在RNase-free 1.5ml离心管中配制以下溶液B：
| 10 × RT Buffer | 2μl |
| RT Enzyme Mix | 1μl |
| RT Primer Mix | 2μl |
| RNase-Free ddH2O | 补足到10μl |
3.将溶液B加到溶液A中，充分混匀。
（五）进行逆转录反应
| 42℃ | 15min |
| 95℃ | 3min |
常见问题及处理方案：
| 低得率 |
A．RNA模板中含有RNase酶，致使RNA降解、cDNA产物量少或无； B．RNA模板中含有蛋白、盐离子、EDTA、乙醇、酚等杂质，影响逆转录酶活性； C．以上操作步骤适用于模板RNA量为50ng-2μg；当模板量≥2μg，请按比例扩大此反应体系。 |
| 后续实验 | A．若后续为实时荧光定量PCR，逆转录产物的加入量应小于PCR体系终体积的1/10；如100μl的PCR反应体系，逆转录产物的加入量应不超过10μl。 |
| 保存 |
A．逆转录产物可置于冰上短暂保存，待后续实验； B．如需要长期保存，请置于-20℃。 |
本产品仅供科研使用，不得用于临床诊断！