产品名称:TRNzol Total RNA Extraction Reagent TRNzol 总 RNA 提取试剂

产品编号:BLGE114

产品规格:100 mL

说明书



产品情况:TRNzol Total RNA Extraction Reagent是基于传统TRNzol开发的总RNA提取试剂。本品适用范围广泛,灵敏度、裂解能力和稳定性更高,可快速、充分的从细菌、病毒、微生物、动物、植物的组织、细胞和体液等样本中提取总RNA,并保证其完整性。
本品可最大限度消除DNA和蛋白等杂质的污染,在分子克隆、Northern Blot、PolyA筛选、体外翻译、RNase保护分析等多种实验方案中实验稳定,结果可靠。对于小量样品(50-100mg组织、5×106细胞),或大量样品(≥1g组织或≥107细胞)的总RNA提取需求均可满足。

储存运输:本品2~8℃避光保存或运输,保质期12个月。

注意事项:
(一)使用本品时注意防护,如果不慎接触到眼睛,请立即用大量清水冲洗并前往医院治疗;接触到皮肤,请立即用大量去垢剂和清水冲洗,如仍有不适,请前往医院治疗。
(二)RNA提取的关键在于防止RNase污染,请:
          1.更换一次性手套;
          2.在洁净区域操作;
          3.佩戴口罩,避免在操作过程中讲话;
          4.使用RNase-Free的塑料制品和枪头;
          5.使用150℃烘烤4小时的方式清洁玻璃类器皿;
          6. 0.5M NaOH中浸泡10min的方式清洁塑料类器皿;
          7.使用RNase-Free ddH2O配制溶液;
          8. RNase-Free ddH2O分装保存,RNA实验用试剂专用。
(三)样本保存
          1. -70℃可保存匀浆后的样品1个月;
          2. RNA沉淀可保存于75%乙醇,2-8℃ 1周或-20℃ 1年。

实验流程:
(一)自备产品
氯仿、异丙醇、75%乙醇(RNase-Free ddH2O配置)、RNase-Free ddH2O
(二)样品处理
         1.细胞
             1.1贴壁细胞
                     收集的细胞数量请不要超过1×107;可直接在体积不超过10cm2培养容器中裂解,或使用胰蛋白酶处理后,离心收集细胞沉淀。
                     1)直接裂解法
                           Ø 去除培养液后,用1×PBS清洗细胞;
                           Ø 在培养容器中加入TRNzol Total RNA Extraction Reagent试剂裂解细胞,每10cm2面积加入1 ml本品;
                           Ø 将裂解液转移至1.5ml离心管中用移液器反复吹打,至充分裂解,室温静置5 min。
注意:本品吸取量取决于培养板面积,而非细胞数。请充分将本品覆盖至细胞表面,并用移液器吹打使之脱落;对于贴壁牢固的细胞可用细胞刮剥离。
请适量加足TRNzol Total RNA Extraction Reagent的用量,如本品使用量不足可导致提取的RNA中掺入DNA污染。
                     2)胰蛋白酶处理法
                           Ø 去除培养液后,用1×PBS清洗细胞;
                           Ø 去除PBS后,加入含0.25%胰蛋白酶的PBS处理细胞。待细胞脱离容器壁时,加入含有血清的培养基终止反应;
                           Ø 将细胞溶液转移至RNase-Free的离心管中,300×g离心5min,收集细胞沉淀;
                           Ø 每5×106~1×107细胞中加入1ml TRNzol Total RNA Extraction Reagent试剂裂解细胞,室温静置5min。
注意:收集细胞时请将细胞培养液除净,否则可因裂解不完全导致RNA的产量降低。
            1.2悬浮细胞
                           Ø 离心取细胞;
                           Ø 每5×106~1×107动物或植物细胞中加入1ml TRNzol Total RNA Extraction Reagent试剂;
                           Ø 移液器反复吹打至充分裂解,室温静置5min。
注意:加入本品前不要洗涤细胞,以免降解mRNA。 
       2.组织
            2.1动物组织
                           Ø 液氮速冻新鲜组织,并快速转移至液氮预冷的研钵中,研磨至无明显颗粒的粉末状;
                           Ø 每30~50mg组织加入1ml TRNzol Total RNA Extraction Reagent试剂,样品体积一般不要超过本品体积的10%;
                           Ø 静置样品混悬液5min,待完全融化后吹打至裂解液透明。
            2.2植物组织
                           Ø 液氮研磨新鲜叶片或将叶片剪碎后在含TRNzol Total RNA Extraction Reagent试剂的研钵中研磨,控制时间在1min内;100mg叶片请使用1ml本品;
                           Ø 静置样品混悬液5 min,待完全融化后吹打至裂解液透明。
       3.病毒液与血液
                           Ø 取新鲜的血液或病毒液加入3倍体积TRNzol Total RNA Extraction Reagent试剂充分振荡混匀;
                           Ø 室温放置5min,使核酸蛋白复合物完全分离。
(三)RNA分离
        1. 4℃ 12,000rpm(~13,400×g)离心10min,取上清。
注意:含较多蛋白、脂肪、多糖或肌肉、植物结节的样品可使用离心方式去除,收集的沉淀包括细胞外膜、多糖、高分子量DNA,在上清中含有RNA。在制备脂肪组织样品时,应除去上层的大量油脂,取澄清的匀浆溶液进行后续操作。
        2.每使用1ml TRNzol Total RNA Extraction Reagent试剂加入0.2ml氯仿,混合均匀后用涡旋仪剧烈振荡15sec,或手动快速颠倒混匀2min。
        3.室温放置3min后,于4℃ 12,000rpm(~13,400×g)离心15min,此时样品将分为三层:粉色的,为有机相;中间层和上层无色的,为水相,RNA主要在水相。将水相(约500µl)转移至新的离心管中。
        4.将得到的水相溶液中加入等体积异丙醇,混匀。
        5.室温放置10 min后,于4℃ 12,000rpm(~13,400×g)离心10min,去上清。
注意:离心前RNA沉淀常不易发现,离心后可在管侧和管底观察到胶状沉淀。
        6.用RNase-Free ddH2O配置75%乙醇,取1ml洗涤沉淀。
注意:按TRNzol Total RNA Extraction Reagent:75%乙醇为1:1的比例使用,如每使用1ml TRNzol Total RNA Extraction Reagent试剂,请取用1ml 75%乙醇洗涤沉淀。
        7. 4℃ 10,000rpm(~9,391×g)离心5min后,废弃液体。注意不要倒出沉淀,剩余的少量液体短暂离心后,用枪头吸出。
注意:保留沉淀,不要误弃。
        8.室温放置晾干后,根据实验需求加入30-100µl RNase-Free ddH2O,反复吹打,充分溶解RNA。
注意:RNA不要晾的过干,以防后期RNA难以溶解。控干时间请控制在2-3min。
        9.待RNA完全溶解后,取少量检测,其余在-80℃保存。
注意:RNA可以分装于-85~-65℃长期保存,而-30~-15℃仅可短期保存。
        10.产物检测方案
                           Ø 浓度:采用分光光度计检测,RNA浓度(ng/µl)=OD260×稀释倍数×40;或采用Qubit直接检测。
                           Ø 纯度:采用分光光度计检测,OD260/OD280比值在1.8~2.2之间表明RNA纯度较高。
                           Ø 完整性:取0.5~1µgRNA,用1×TE或RNase-Free ddH2O稀释至8µl后,加入1µl 10×DNA loading buffer进行1%琼脂糖凝胶电泳;或采用2100检测,测定RNA产物的RIN值。
常见问题及处理方案:
RNA降解 A.细胞或组织取出后没有马上处理或冷冻;针对内源RNase含量高或不易匀浆的组织,需将组织切成小块后立即投入液氮冷冻并研磨。在整个研磨过程中,样品不得融化;
B.样品或提取的RNA沉淀保存于-20℃–室温,未在-80℃– -60℃保存;
C.细胞在胰蛋白酶处理时被破坏;
D.溶液或离心管未经RNase去除处理;
E.提取的RNA有基因组污染;
F.电泳时使用的甲酰胺pH低于3.5。
低得率 A.样品裂解或匀浆处理不彻底;
B.在加入异丙醇的手续步骤中,误弃RNA;
C.最后得到的RNA沉淀未完全溶解。
A260/ A280<1.65 A.检测吸光度时,RNA样品不是溶于TE,而是溶于水。低离子浓度和低pH条件下,A280值会较高;
B.样品匀浆时加入的本品体积太少;
C.匀浆后样品未在室温放置5 min;
D.水相中混有有机相;或误弃水相成分;
E.最后得到的RNA沉淀未完全溶解。
DNA污染 A.样品匀浆时加的本品体积太少;
B.样品中含有组织溶剂(如乙醇、DMSO等),强缓冲液或碱性溶液。
蛋白和多糖污 染 A.样品中蛋白、多糖含量高;
B.水相中混有有机相。

 
本产品仅供科研使用,不得用于临床诊断!