产品名称：TRNzol Total RNA Extraction Reagent TRNzol 总 RNA 提取试剂

产品编号：BLGE114

产品规格：100 mL

说明书

产品情况：TRNzol Total RNA Extraction Reagent是基于传统TRNzol开发的总RNA提取试剂。本品适用范围广泛，灵敏度、裂解能力和稳定性更高，可快速、充分的从细菌、病毒、微生物、动物、植物的组织、细胞和体液等样本中提取总RNA，并保证其完整性。
本品可最大限度消除DNA和蛋白等杂质的污染，在分子克隆、Northern Blot、PolyA筛选、体外翻译、RNase保护分析等多种实验方案中实验稳定，结果可靠。对于小量样品（50-100mg组织、5×10⁶细胞），或大量样品（≥1g组织或≥10⁷细胞）的总RNA提取需求均可满足。

储存运输：本品2~8℃避光保存或运输，保质期12个月。

注意事项：
（一）使用本品时注意防护，如果不慎接触到眼睛，请立即用大量清水冲洗并前往医院治疗；接触到皮肤，请立即用大量去垢剂和清水冲洗，如仍有不适，请前往医院治疗。
（二）RNA提取的关键在于防止RNase污染，请：
          1.更换一次性手套；
          2.在洁净区域操作；
          3.佩戴口罩，避免在操作过程中讲话；
          4.使用RNase-Free的塑料制品和枪头；
          5.使用150℃烘烤4小时的方式清洁玻璃类器皿；
          6. 0.5M NaOH中浸泡10min的方式清洁塑料类器皿；
          7.使用RNase-Free ddH₂O配制溶液；
          8. RNase-Free ddH₂O分装保存，RNA实验用试剂专用。
（三）样本保存
          1. -70℃可保存匀浆后的样品1个月；
          2. RNA沉淀可保存于75%乙醇，2-8℃ 1周或-20℃ 1年。

实验流程：
（一）自备产品
氯仿、异丙醇、75%乙醇(RNase-Free ddH₂O配置)、RNase-Free ddH₂O
（二）样品处理
         1.细胞
             1.1贴壁细胞
                     收集的细胞数量请不要超过1×10⁷；可直接在体积不超过10cm²培养容器中裂解，或使用胰蛋白酶处理后，离心收集细胞沉淀。
                     1）直接裂解法
                           Ø 去除培养液后，用1×PBS清洗细胞；
                           Ø 在培养容器中加入TRNzol Total RNA Extraction Reagent试剂裂解细胞，每10cm²面积加入1 ml本品；
                           Ø 将裂解液转移至1.5ml离心管中用移液器反复吹打，至充分裂解，室温静置5 min。
注意：本品吸取量取决于培养板面积，而非细胞数。请充分将本品覆盖至细胞表面，并用移液器吹打使之脱落；对于贴壁牢固的细胞可用细胞刮剥离。
请适量加足TRNzol Total RNA Extraction Reagent的用量，如本品使用量不足可导致提取的RNA中掺入DNA污染。
                     2）胰蛋白酶处理法
                           Ø 去除培养液后，用1×PBS清洗细胞；
                           Ø 去除PBS后，加入含0.25%胰蛋白酶的PBS处理细胞。待细胞脱离容器壁时，加入含有血清的培养基终止反应；
                           Ø 将细胞溶液转移至RNase-Free的离心管中，300×g离心5min，收集细胞沉淀；
                           Ø 每5×10⁶~1×10⁷细胞中加入1ml TRNzol Total RNA Extraction Reagent试剂裂解细胞，室温静置5min。
注意：收集细胞时请将细胞培养液除净，否则可因裂解不完全导致RNA的产量降低。
            1.2悬浮细胞
                           Ø 离心取细胞；
                           Ø 每5×10⁶~1×10⁷动物或植物细胞中加入1ml TRNzol Total RNA Extraction Reagent试剂；
                           Ø 移液器反复吹打至充分裂解，室温静置5min。
注意：加入本品前不要洗涤细胞，以免降解mRNA。 
       2.组织
            2.1动物组织
                           Ø 液氮速冻新鲜组织，并快速转移至液氮预冷的研钵中，研磨至无明显颗粒的粉末状；
                           Ø 每30~50mg组织加入1ml TRNzol Total RNA Extraction Reagent试剂，样品体积一般不要超过本品体积的10%；
                           Ø 静置样品混悬液5min，待完全融化后吹打至裂解液透明。
            2.2植物组织
                           Ø 液氮研磨新鲜叶片或将叶片剪碎后在含TRNzol Total RNA Extraction Reagent试剂的研钵中研磨，控制时间在1min内；100mg叶片请使用1ml本品；
                           Ø 静置样品混悬液5 min，待完全融化后吹打至裂解液透明。
       3.病毒液与血液
                           Ø 取新鲜的血液或病毒液加入3倍体积TRNzol Total RNA Extraction Reagent试剂充分振荡混匀；
                           Ø 室温放置5min，使核酸蛋白复合物完全分离。
（三）RNA分离
        1. 4℃ 12,000rpm(~13,400×g)离心10min，取上清。
注意：含较多蛋白、脂肪、多糖或肌肉、植物结节的样品可使用离心方式去除，收集的沉淀包括细胞外膜、多糖、高分子量DNA，在上清中含有RNA。在制备脂肪组织样品时，应除去上层的大量油脂，取澄清的匀浆溶液进行后续操作。
        2.每使用1ml TRNzol Total RNA Extraction Reagent试剂加入0.2ml氯仿，混合均匀后用涡旋仪剧烈振荡15sec，或手动快速颠倒混匀2min。
        3.室温放置3min后，于4℃ 12,000rpm(~13,400×g)离心15min，此时样品将分为三层：粉色的，为有机相；中间层和上层无色的，为水相，RNA主要在水相。将水相（约500µl）转移至新的离心管中。
        4.将得到的水相溶液中加入等体积异丙醇，混匀。
        5.室温放置10 min后，于4℃ 12,000rpm(~13,400×g)离心10min，去上清。
注意：离心前RNA沉淀常不易发现，离心后可在管侧和管底观察到胶状沉淀。
        6.用RNase-Free ddH₂O配置75%乙醇，取1ml洗涤沉淀。
注意：按TRNzol Total RNA Extraction Reagent：75%乙醇为1:1的比例使用，如每使用1ml TRNzol Total RNA Extraction Reagent试剂，请取用1ml 75%乙醇洗涤沉淀。
        7. 4℃ 10,000rpm(~9,391×g)离心5min后，废弃液体。注意不要倒出沉淀，剩余的少量液体短暂离心后，用枪头吸出。
注意：保留沉淀，不要误弃。
        8.室温放置晾干后，根据实验需求加入30-100µl RNase-Free ddH₂O，反复吹打，充分溶解RNA。
注意：RNA不要晾的过干，以防后期RNA难以溶解。控干时间请控制在2-3min。
        9.待RNA完全溶解后，取少量检测，其余在-80℃保存。
注意：RNA可以分装于-85~-65℃长期保存，而-30~-15℃仅可短期保存。
        10.产物检测方案
                           Ø 浓度：采用分光光度计检测，RNA浓度(ng/µl)=OD₂₆₀×稀释倍数×40；或采用Qubit直接检测。
                           Ø 纯度：采用分光光度计检测，OD₂₆₀/OD₂₈₀比值在1.8~2.2之间表明RNA纯度较高。
                           Ø 完整性：取0.5~1µgRNA，用1×TE或RNase-Free ddH₂O稀释至8µl后，加入1µl 10×DNA loading buffer进行1%琼脂糖凝胶电泳；或采用2100检测，测定RNA产物的RIN值。
常见问题及处理方案：

RNA降解	A．细胞或组织取出后没有马上处理或冷冻；针对内源RNase含量高或不易匀浆的组织，需将组织切成小块后立即投入液氮冷冻并研磨。在整个研磨过程中，样品不得融化； B．样品或提取的RNA沉淀保存于-20℃–室温，未在-80℃– -60℃保存； C．细胞在胰蛋白酶处理时被破坏； D．溶液或离心管未经RNase去除处理； E．提取的RNA有基因组污染； F．电泳时使用的甲酰胺pH低于3.5。
低得率	A．样品裂解或匀浆处理不彻底； B．在加入异丙醇的手续步骤中，误弃RNA； C．最后得到的RNA沉淀未完全溶解。
A260/ A280<1.65	A．检测吸光度时，RNA样品不是溶于TE，而是溶于水。低离子浓度和低pH条件下，A280值会较高； B．样品匀浆时加入的本品体积太少； C．匀浆后样品未在室温放置5 min； D．水相中混有有机相；或误弃水相成分； E．最后得到的RNA沉淀未完全溶解。
DNA污染	A．样品匀浆时加的本品体积太少； B．样品中含有组织溶剂（如乙醇、DMSO等），强缓冲液或碱性溶液。
蛋白和多糖污 染	A．样品中蛋白、多糖含量高； B．水相中混有有机相。

 
本产品仅供科研使用，不得用于临床诊断！