产品编号： BLGE059
产品规格： 10T
| 组分编号 | 产品组成 |
BLGE059 (10T) |
| BLGE299-30ML | 平衡液BL (Buffer BL) | 30 mL |
| BLGE300-100ML | 溶液P1 (Buffer P1) | 100 mL |
| BLGE301-100ML | 溶液P2 (Buffer P2) | 100 mL |
| BLGE302-100ML | 溶液P4 (Buffer P4) | 100 mL |
| BLGE303-70ML | 漂洗液PW (Buffer PW) | 70 mL |
| BLGE304-30ML | 洗脱缓冲液TB (Buffer TB) | 30 mL |
| BLGE305-500UL | RNA酶A(RNase A (100 mg/mL)) | 500 μL |
| BLGE306-10pcs | 过滤器CS1 (Filtration CS1) | 10个 |
| BLGE307-10pcs | 吸附柱CP6 (Spin Columns CP6) | 10个 |
| BLGE308-20pcs | 收集管(50 ml) (Collection Tubes (50 ml)) | 20个 |
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说明书 |
产品情况：本试剂盒采用独特的硅胶膜吸附技术，高效专一地结合质粒DNA。同时采用特殊的溶液
P4和过滤器CS1，可有效的去除内毒素、蛋白等杂质；整个提取过程仅需1h，方便快捷。
推荐过夜培养的大肠杆菌菌液使用量为：高拷贝质粒推荐使用量为100 mL，得率一般在500 - 1500μg左右；低拷贝质粒推荐使用量为200 mL，得率一般在200 - 600 μg左右。质粒的提取得率和质量与宿主菌的种类、培养条件、菌体裂解、质粒拷贝数、质粒稳定性、抗生素等因素有关。
使用本试剂盒提取的质粒DNA适用于各种常规操作，包括酶切、PCR、测序、连接、转化和转染多种细胞等实验。
储存运输：常温运输；
试剂盒在15 - 25℃干燥室温条件下，可保存12个月；
试剂盒在2 - 8℃条件下可保存更长时间，若溶液产生沉淀，应在使用前于37℃溶解沉淀；
单独包装的RNaseA在室温可稳定保存12个月以上；
加入RNaseA的溶液P1在2 - 8℃条件下可稳定保存6个月。
注意事项：
（一）溶液P1在使用前先加入全部的RNase A 并混匀，放入2 - 8℃保存；
（二）第一次使用前应按照瓶签说明，先在漂洗液PW中加入无水乙醇；
（三）使用前先检查平衡液BL、溶液P2和P4是否出现结晶或者沉淀，如有结晶或者沉淀现象，可在37℃水浴中加热几分钟，即可恢复澄清；
（四）实验前使用平衡液BL处理吸附柱，可以最大限度激活硅基质膜，提高得率。但用平衡液处理过的柱子最好立即使用，放置时间过长会影响使用效果；
（五）注意不要直接接触溶液P2和P4，使用后应立即盖紧盖子；
（六）使用过滤器时请将推柄小心缓慢地从过滤管中抽出，避免滤膜因压力而松动；
（七）提取的质粒量与细菌培养浓度、质粒拷贝数等因素有关。如果所提质粒为低拷贝质粒或大于10 kb的大质粒，应加大菌体使用量，同时按比例增加P1、P2、P4的用量；洗脱缓冲液推荐在65 - 70℃水浴中预热。可以适当延长吸附和洗脱时间，以提高提取效率。
实验流程：
注意：
第一次使用前应按照瓶签说明先在溶液P1中加入全部的RNase A；
第一次使用前应按照瓶签说明先在漂洗液PW中加入无水乙醇。
（一）步骤1
加2.5 mL的平衡液BL至吸附柱CP6中（吸附柱放入50mL收集管中），8,000 rpm (~8,228×g)离心2 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
注意：用平衡液处理过的柱子最好立即使用，放置时间过长会影响使用效果。
（二）步骤2
取100 mL（根据培养的菌体的浓度选择合适的量，低拷贝推荐用200 mL）过夜培养的菌液加入离心管，室温，8,000 rpm (~8,228×g)离心3 min收集细菌，尽量吸除上清。
注意：
（1）可以通过多次离心的方法将较多菌液的菌体沉淀收集到一个离心管中, 菌体量以保证充分裂解为宜，避免过多的菌体导致的裂解不充分，从而降低质粒的提取效率。
（2）尽量吸除上清，为确保上清液全部吸取，请用干净的吸水纸吸去瓶壁上的水滴。
（三）步骤3
加8 mL溶液P1至留有菌体沉淀的离心管中（请先检查是否已加入RNase A），使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀。
注意：充分悬浮细菌沉淀，如果有未混匀的菌块，会影响裂解，导致质粒提取量和纯度偏低。对于低拷贝质粒，加大菌体用量的同时按比例增加P1、P2、P4的用量。
（四）步骤4
加8 mL溶液P2至离心管中，立即温和地上下翻转6 - 8次，使菌体充分裂解，室温放置5 min。
注意：混合时务必温和，以免发生基因组DNA污染。混合后菌液应变得清亮粘稠，裂解时间控制在5 min内，以免质粒受到破坏。如果未变清亮，可能由于菌体过多，导致裂解不彻底，应减少菌体量。
（五）步骤5
加8 mL溶液P4至离心管中，立即温和地上下翻转6 - 8次以充分混匀，至溶液出现白色分散絮状沉淀。然后室温放置10 min左右。8,000 rpm (~8,228×g)离心5 - 10 min，使白色沉淀离至管底（可适当增加离心时间），将全部溶液小心（缓慢的）倒入过滤器CS1中（请避免倒入大量沉淀而阻塞过滤器），慢慢推动推柄过滤，滤液收集在干净的50 mL的管中（自备）。
注意：加入溶液P4后应立即混匀，避免产生局部沉淀。如果离心后倒入过滤器CS1中的溶液有白色沉淀也不会影响过滤。如果菌体过多（>100 mL），推荐延长离心时间至20 - 30 min。
（六）步骤6
加入0.3倍滤液体积的异丙醇至滤液中，上下颠倒混匀后转移到吸附柱CP6中（吸附柱放入50 mL收集管中）。
注意：过滤后滤液会损失，根据损失的不同请加入不同体积的异丙醇，加入异丙醇过多容易导致RNA污染。吸附柱CP6的最大容积为15 mL，所以需要分2次过柱。个别情况下离心机角转子倾角较大，此时，建议加入吸附柱CP6的溶液体积不超过10 mL，以防漏液。
（七）步骤7
室温8,000 rpm (~8,228×g)离心2 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP6重新放回收集管中。
注意：将第6步中所得溶液分2次过柱，每次均按以上条件操作。
（八）步骤8
加10 mL漂洗液PW（请先检查是否已加入无水乙醇）至吸附柱CP6中，8,000 rpm
(~8,228×g)离心2 min，弃掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
注意：重复步骤8一次。
（九）步骤9
加3 mL无水乙醇至吸附柱CP6中，室温8,000 rpm (~8,228×g)离心2 min，倒掉废液。
（十）步骤10
将吸附柱CP6重新放回收集管中，8,000 rpm (~8,228×g)离心5 min，去除吸附柱中残余的漂洗液。
注意：漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶促反应（酶切、PCR等）实验。建议将吸附柱CP6开盖，置于室温放置数分钟，彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液，以确保下游实验不受残留乙醇的影响。
（十一）步骤11
将吸附柱CP6置于一个干净的50 mL收集管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加1 - 2 mL洗脱缓冲液TB，室温放置5 min，然后室温8,000 rpm (~8,228×g)离心2 min。将50 mL离心管中的洗脱液全部移入一个干净的1.5 mL离心管，-20℃保存。
注意：可将得到的溶液重新加入到吸附柱中，重复步骤11，以增加质粒的回收效率。若用ddH2O做洗脱液应保证其pH值在7.5 - 8.0范围内，pH值低于7.0会降低洗脱效率，洗脱液的pH值对于洗脱效率有很大影响。洗脱液用量的多少主要是根据质粒的拷贝数以及实验所需要的浓度来确定。洗脱液体积不少于1 mL，体积过小会影响回收效率。DNA产物应保存在-20℃，以防降解。
（十二）步骤12（可选步骤）
加1.42 mL异丙醇以及0.42 mL 5mol/L的 NaCl (自备)至每1 mL洗脱液中，混匀，室温放置5 min，8,000 rpm (~8,228×g)离心10 min，小心弃上清。
（十三）步骤13（可选步骤）
加入0.5 mL 的70%乙醇洗涤沉淀, 室温 8,000 rpm (~8,228×g)离心5 min，小心弃乙醇。
注意：重复步骤13一次。
（十四）步骤14（可选步骤）
空气中干燥沉淀约5 - 10 min, 根据需要用适当体积的TB缓冲液溶解沉淀。
质量检测
（一）可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测得到的质粒浓度与纯度。OD260值为1相当于大约50 μg/mL 双链DNA。纯化的质粒 OD260/OD280通常在1.8 - 2.0左右，可直接应用于细胞转染甚至动物体内实验等对质粒纯度要求很高的实验中。
（二）如果洗脱时使用去离子水而不使用洗脱缓冲液，OD260/OD280比值会偏低，但并不表示纯度低，因为pH值和离子的存在会影响光吸收值。
本产品仅供科研使用，不得用于临床诊断！