产品名称：EndoFree Mini Plasmid Kit II 无内毒素质粒小提中量试剂盒
产品编号：BLGE060
产品规格：
| 组分编号 | 产品组成 |
BLGE060 (50T) |
BLGE060 (5T) |
| BLGE299-30ML | 平衡液BL (Buffer BL) | 30 mL | 3 mL |
| BLGE300-30ML | 溶液P1 (Buffer P1) | 30 mL | 3 mL |
| BLGE301-30ML | 溶液P2 (Buffer P2) | 30 mL | 3 mL |
| BLGE302-30ML | 溶液P4 (Buffer P4) | 30 mL | 3 mL |
| BLGE309-30ML | 去蛋白液PD (Buffer PD) | 30 mL | 3 mL |
| BLGE303-15ML | 漂洗液PW (Buffer PW) | 15 mL | 1.5 mL |
| BLGE304-15ML | 洗脱缓冲液TB (Buffer TB) | 15 mL | 1.5 mL |
| BLGE305-300μl | RNaseA (10 mg/mL) | 300 μL | 30 μL |
| BLGE311-50pcs | 过滤柱CS (Filtration Columns CS) | 50个 | 5个 |
| BLGE307-50pcs | 吸附柱CP4 (Spin Columns CP4) | 50个 | 5个 |
| BLGE308-100pcs | 收集管(2 mL) (Collection Tubes 2 mL) | 50个× 2 | 10个 |
产品情况：本试剂盒采用了可高效专一结合质粒DNA的硅胶膜吸附技术。同时采用特殊的溶液P4和过滤柱CS，可有效的去除内毒素、蛋白等杂质；整个提取过程仅需1个小时，方便快捷。
推荐过夜培养的大肠杆菌菌液使用量为5 - 15 mL每次，高拷贝质粒得率一般在15 - 70 µg左右；低拷贝质粒得率一般在100 - 300 µg左右。质粒的提取得率和质量与宿主菌的种类、培养条件、菌体裂解、质粒拷贝数、质粒稳定性、抗生素等因素有关。
使用本试剂盒提取的质粒DNA可适用于转染多种细胞及各种常规操作，包括酶切、PCR、测序、连接等实验。
储存运输：常温运输；
试剂盒在15 - 25℃干燥室温条件下，可保存12个月；
试剂盒在2 - 8℃条件下可保存更长时间；
单独包装的RNaseA在室温可稳定保存12个月以上；
溶液P1加入RNaseA后，在2 - 8℃条件下可稳定保存6个月。
注意事项：
在使用本试剂盒之前请务必阅读此注意事项！
（一）当试剂盒在2 - 8℃低温贮存时，使用前应先将试剂盒内的溶液在室温中放置一段时间，必要时可在37℃水浴中预热10 min，以平衡溶液温度；
（二）溶液P1在使用前先加入全部的RNase A 并混匀，放入2 - 8℃保存；
（三）第一次使用前应按照瓶签说明，先在漂洗液PW中加入无水乙醇；
（四）使用前先检查平衡液BL、溶液P2和P4是否出现结晶或者沉淀，如有结晶或者沉淀，可在37℃水浴中加热几分钟以使其恢复澄清；
（五）实验前使用平衡液BL处理吸附柱，可以最大限度激活硅基质膜，提高得率；但用平衡液处理过的柱子最好立即使用，放置时间过长会影响使用效果；
（六）注意不要直接接触溶液P2和P4，使用后应立即盖紧盖子；
（七）提取的质粒量与细菌培养浓度、质粒拷贝数等因素有关；如果所提质粒为低拷贝质粒或大于10 kb的大质粒，应加大菌体使用量，同时按比例增加P1、P2、P4的用量，洗脱缓冲液应在65 - 70℃预热，可以适当的延长吸附和洗脱的时间，以增加提取效率；
（八）所有离心步骤均为使用台式离心机室温下进行离心，速度为12,000 rpm (~13,400×g )。
实验流程：
注意：
第一次使用前应按照瓶签的说明先在溶液P1中加入全部的RNase A；
第一次使用前应按照瓶签的说明先在漂洗液PW中加入无水乙醇。
（一）步骤1
加500μL的平衡液BL至吸附柱CP4中（吸附柱放入收集管中），12,000 rpm (~13,400×g ) 离心1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
注意：用平衡液处理过的柱子最好立即使用，放置时间过长会影响使用效果。
（二）步骤2
取5 - 15 mL过夜培养的菌液加入离心管中，12,000 rpm (~13,400×g ) 离心1 min，尽量吸除上清。
注意：可以通过多次离心的方法将较多菌液的菌体沉淀收集到一个离心管中, 菌体量以保证充分裂解为宜，避免过多的菌体导致的裂解不充分，从而降低质粒的提取效率。
（三）步骤3
加500μL溶液P1至离心管中（请检查是否已加入RNaseA），使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀。
注意：充分悬浮细菌沉淀，如果有未混匀的菌块，会影响裂解，导致质粒提取量和纯度偏低。
（四）步骤4
加500μL溶液P2至离心管中，温和地上下翻转6 - 8次使菌体充分裂解。
注意：务必温和混合，以免发生基因组DNA污染。混合后菌液应变得清亮粘稠，裂解时间控制在5 min内，以免质粒受到破坏。如果未变清亮，可能由于菌体过多，导致裂解不彻底，应减少菌体量。
（五）步骤5
加500μL溶液P4至离心管中，立即温和地上下翻转6 - 8次，充分混匀，此时会出现白色絮状沉淀，然后室温放置10 min左右，12,000 rpm (~13,400×g ) 离心10 min，此时沉淀在离心管底部聚集；如果上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后收取上清。
注意：P4加入后应立即混合，避免产生局部沉淀。
（六）步骤6
将步骤5收集的上清液分次加入过滤柱CS（过滤柱放入收集管中），12,000 rpm (~13,400×g ) 离心2 min，自备干净的2 mL离心管，收集滤液。
（七）步骤7
加0.3倍滤液体积的异丙醇至滤液中，上下颠倒混匀后转移到吸附柱CP4中（吸附柱放入收集管中），室温12,000 rpm (~13,400×g)离心1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
注意：过滤后滤液会损失，根据损失的不同请加入不同体积的异丙醇，加入异丙醇过多容易导致RNA污染。吸附柱CP4的最大容积为700μL，所以需要分次过柱。
（八）步骤8
加500μL去蛋白液PD至吸附柱CP4中，12,000 rpm (~13,400×g )离心1 min，倒掉 收集管中的废液，将吸附柱CP4放入收集管中。
（九）步骤9
加600μL漂洗液PW至吸附柱CP4中（请先检查是否已加入无水乙醇），12,000 rpm
(~13,400×g ) 离心1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP4放入收集管中。
注意：加入漂洗液PW后室温静置2 - 5 min，有助于更好地溶解去除杂质。
（十）步骤10
重复步骤9一次。
（十一）步骤11
将吸附柱CP4重新放回收集管中，12,000 rpm (~13,400×g ) 离心2 min，去除吸附柱中残余的漂洗液。
注意：漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应（酶切、PCR等）实验。建议将吸附柱CP4开盖，置于室温放置数分钟，彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液，以确保下游实验不受残留乙醇的影响。
（十二）步骤12
悬空滴加100 - 300μL洗脱缓冲液TB至吸附膜的中间部位（吸附柱CP4置于一个干净的离心管中），室温放置2 min，12,000 rpm (~13,400×g ) 离心1 min将质粒溶液收集到离心管中。
注意：可将得到的溶液重新加入到吸附柱中，重复步骤12，以增加质粒的回收效率。洗脱液的pH值对于洗脱效率有很大影响。若用ddH2O做洗脱液应保证其pH值7.5 - 8.0 范围内，pH值低于7.0会降低洗脱效率。洗脱缓冲液用量不应少于100μL，体积过小影响回收效率。且DNA产物应保存在 - 20℃，以防DNA降解。
质量检测：
（一）可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测得到的质粒浓度与纯度。OD260值为1相当于大约50 μg/mL 双链DNA。纯化的质粒 OD260/OD280通常在1.7 - 1.9左右，可直接应用于细胞转染甚至动物体内实验等对质粒纯度要求很高的实验中。
（二）如果洗脱时使用ddH2O而不使用洗脱缓冲液，OD260/OD280比值会偏低，但并不表示纯度低，因为pH值和离子的存在会影响光吸收值。
本产品仅供科研使用，不得用于临床诊断！