产品名称：彩色荧光定量预混试剂盒(SYBR Green)
产品编号：BLGE146
产品规格：
产品组成 BLGE146-01（125rxn） BLGE146-02（500rxn） BLGE146-03（2500rxn）
2×PreMix (SYBR Green, blue) 1.25ml 4×1.25ml 5×BLGE146-02
50×ROX Reference Dye 250µl 1ml 5×BLGE146-02
40×Dilution Buffer (Yellow) 1.25ml 1.25ml 5×BLGE146-02
RNase-Free ddH2O 2×1ml 5×1ml 5×BLGE146-02

说明书

产品情况：Color PreMix Kit(SYBR Green)试剂盒选用Real Time PCR专用试剂进行SYBR Green I 嵌合荧光法qPCR反应，核心成分为高效化学修饰、新型抗体法制备、耐热Taq DNA聚合酶。为充分发挥热启动酶特异性强、灵敏度高的特点，本品配套改良了缓冲液体系，使其更具扩增速率快、得率高、特异性强和可信区间宽的优势，对不同丰度、来源的靶基因都极为适用。
产品特色如下：额外添加了蓝色指示剂与黄色样本稀释液，将有利于大量样品的稀释和加样，减少操作误差；Buffer体系中平衡了K+和NH4+的比例，从而增加了扩增的可信区间、稳定性和特异性；预混液中只需加入模板、引物、RNase-Free ddH2O便可进行Real Time PCR反应，操作简单方便、快捷；ROX Reference Dye可方便用户选用针对不同型号的荧光定量PCR仪，本品的核心组分能充分消除信号本底、校正孔、批间差等带来的荧光信号误差。

储存运输：本品需在-30~-15℃条件下避光保存；运输条件应≤0℃。
                          本品解冻后，可在2~8℃避光条件下稳定存放3-6个月。

注意事项：
（一）实验前，待使用的2×PreMix和50×ROX Reference Dye请充分解冻。2×PreMix解冻后可能会出现少许白色沉淀，请室温放置2min并轻柔颠倒混匀，待溶液成分完全均一后再行使用；
（二）解冻后如未使用，须彻底混匀后重新冻存；非均一的混合液在冻融过程中，会形成的盐晶体出现分层、析出现象，对酶活性造成损害；
（三）PCR反应的预变性条件必须设定为95℃ 15min，用以充分激活耐热聚合酶；
（四）PCR反应液中各颜色指示剂终浓度应为1×，请根据模板的用量计算Dilution Buffer的使用量；
（五）20 μl反应体系中，建议基因组DNA或cDNA模板使用量≤100ng；逆转录产物作为模板时，使用量应≤PCR体系终体积的10%；当模板浓度较低时，可直接用cDNA原液作为模板使用，未稀释的模板不会影响定量结果；
（六）避免反复冻融；本品含有荧光染料SYBR Green I，保存或配制时应避免强光照射；
（七）使用前，可上下颠倒或快速离心以充分混匀试剂，请不要使用涡旋仪避免出现泡沫；
（八）引物终浓度为0.3μM时，扩增效果最为稳定；如需要进一步优化，可以在0.2-0.5μM范围内微调引物浓度。

实验流程：
（一）自备产品
           RNase-free 1.5ml离心管、PCR管、移液器及吸头、PCR仪、冰或移动冰盒
（二）实验准备
          1.设定各相应规格的反应体系；
          2.解冻模板、引物、2×PreMix、50×ROX Reference Dye、40×Dilution Buffer和RNase-Free ddH2O；并将所有试剂在室温条件下平衡、混匀。
（三）Real Time PCR反应液的配制
          1.在qPCR管中配制以下溶液A，冰上操作：
           384孔反应体系： 
组分 终浓度 5 μl体系 10 μl体系 15 μl体系 20 μl体系
2×PreMix 1× 2.5 μl 5 μl 7.5 μl 10 μl
正向引物(10 μM) 0.3μM◎ 0.15 μl 0.3 μl 0.45 μl 0.6 μl
反向引物(10 μM) 0.3μM◎ 0.15 μl 0.3 μl 0.45 μl 0.6 μl
cDNA模板★ pg~ng / / / /
50×ROX Reference Dye◆ / / / / /
RNase-free ddH2O / 至5 μl 至10 μl 至15 μl 至20 μl
           96孔反应体系：
组分 终浓度 20μl体系 25μl体系 50μl体系
2×PreMix 1× 10μl 12.5μl 25μl
正向引物(10μM) 0.3μM◎ 0.6μl 0.75μl 1.5μl
反向引物(10μM) 0.3μM◎ 0.6μl 0.75μl 1.5μl
cDNA模板★ pg~ng / / /
50×ROX Reference Dye◆ / / / /
RNase-free ddH2O / 至20μl 至25μl 至50μl
注意：2×PreMix为蓝色；40×Dilution Buffer为黄色；稀释模板后，最终反应体系应为绿色。如颜色不符，请确认反应体系中加入组分是否正确。
          2.确认常见仪器匹配的ROX Reference Dye的浓度
仪器 终浓度
ABI7500/7500 Fast/ViiA 7;QuantStudio™;12K Flex;Agilent Mx3000P/Mx3005P/Mx4000 1×（如1 μl ROX/50μl体系）
ABI 5700/7000/7300/7700/7900HT/StepOneTM/StepOne PlusTM 1×（如1 μl ROX/50μl体系）
Roche仪器;Bio-Rad仪器;Eppendorf仪器等 无需添加
注意：◎0.3μM的引物终浓度最为适宜。可增加浓度提高扩增效率；减少浓度降低非特异性扩增；建议在0.2-0.5μM范围内优化引物用量。
          ★将cDNA模板与40×Dilution Buffer按一定比例混合成稀释模板，使Dilution Buffer在定量体系中的终浓度为1×。
          ◆常见仪器匹配的ROX Reference Dye的浓度，见上表。
（四）进行Real time PCR反应
           1.两步扩增法（常规方法）
反应 循环 温度 时间 原理 荧光信号
预变性 1× 95°C 15min 预变性 不采集
PCR 40× 95°C 10sec 变性 不采集
60-66°C♣1 20-32sec* 退火/延伸 采集
熔解曲线分析(Melting/Dissociation Curve Stage)
           
           2.三步扩增法（模板浓度和引物Tm值低、非特异扩增强、扩增曲线重复性差等时，可采用该法）
反应 循环 温度 时间 原理 荧光信号
预变性 1× 95°C 15min 预变性 不采集
PCR 40× 95°C 10sec 变性 不采集
50-60°C♣2 20sec 退火 不采集
72°C 20-32sec* 延伸 采集
熔解曲线分析(Melting/Dissociation Curve Stage)

           3.请按照仪器使用说明书进行实验操作，不同型号仪器的时间设定*如下，
Roche LightCycler/ LightCycler 480 20sec
ABI 7500 Fast/7900HT/7900HT Fast/ViiA 7;StepOne/StepOnePlus 30sec
ABI 7000/7300 31sec
ABI 7500 32sec
 注意：♣1 常规使用60℃退火温度扩增；如需要优化，可尝试在60-66℃ 范围内进行。
            ♣2 常规引物退火温度比引物的解链温度(Tm)低5℃，如引物碱基数较少，可适当提高退火温度提高PCR特异性；如果碱基数较多，则可适当减低退火温度。
           4.盖上反应管，并瞬时离心确保组成混匀。
           5.将反应体系置于荧光定量PCR仪中，开始反应。

常见问题及处理方案：
无扩增曲线出现 A．反应循环数不够；
B．反应循环数过多，增加背景信号；
C．程序中未设置信号采集步骤；
D．引物降解；
E．模板浓度过低；
F．模板降解。
扩增曲线异常 A．曲线不光滑：需提高模板浓度重复实验，或确认ROX与机型是否匹配；
B．曲线断裂或下滑：需调整模板浓度，或减小基线终点，重新分析数据；
C．曲线骤降：检查反应管内是否有气泡。
CT值异常 A．出现太晚
(1)尝试三步扩增法，优化反应条件或重新设计引物，提高扩增效率；
(2)减少稀释度重复实验，提高模板浓度；
(3)重新制备模板，确认模板是否降解；
(4)评估PCR产品是否在80~150bp，防止过长；
(5)加到模板稀释倍数，或重新制备模板重复实验，防止体系中存在由模板带入的PCR抑制剂。
B．阴性对照中出现扩增带
(1)反应体系污染；
(2)引物二聚体干扰。
熔解曲线异常 A．引物设计不适宜；
B．引物浓度过高；
C．cDNA模板有基因组污染。
实验重复性差 A．加样误差；
B．标准品降解；
C．模板浓度不适宜；
E．PCR仪模块内置温度不一致。
 
本产品仅供科研使用，不得用于临床诊断！