产品名称：一步法TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒
产品编号：BLCK010
产品规格：
| 组分编号 | 产品组成 | BLCK010-50T | BLCK010-100T |
| BLCK010-1 | Recombinant TdT Enzyme | 50 µL | 100 µL |
| BLCK010-2 | FITC-12-dUTP Labeling Mix | 250 µL | 500 µL |
| BLCK010-3 | Equilibration Buffer | 5×1 mL | 10×1 mL |
| BLCK010-4 | Proteinase K（200 µg/mL） | 1 mL | 2×1 mL |
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说明书 |
产品情况：一步法TUNEL (TdT mediated dUTP Nick End Labeling)细胞凋亡原位检测试剂盒可以用来检测组织细胞在凋亡晚期过程中细胞核DNA的断裂情况。在阶段性的细胞凋亡过程中，染色体DNA首先在内源性的核酸水解酶的作用下降解为50-300 kb的大片段，然后大约30%的染色体DNA在Ca2+和Mg2+依赖的核酸内切酶作用下，核小体单位之间被随机切断，形成180-200 bp核小体DNA多聚体。因此在细胞凋亡晚期，DNA会被降解为180-200 bp的片段，暴露出大量的3'-OH末端。一步法TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒的原理是在末端脱氧核糖核苷酸转移酶（Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT）的作用下，在基因组DNA断裂时暴露出的3´-OH末端掺入荧光素标记的dUTP（FITC-12-dUTP），从而可以用荧光显微镜或流式细胞仪检测（FITC激发450-500 nm，发射515-565 nm）。本试剂盒适用于石蜡组织切片，冰冻组织切片、细胞爬片、细胞涂片等的细胞凋亡检测，应用范围极广。
储存运输：冰袋运输；-20℃保存，其中FITC-12-dUTP Labeling Mix需-20℃避光保存，有效期12个月。
注意事项：
（一）本产品仅限专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内；
（二）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
流程简介：
实验准备：
（一）需自备用于洗涤细胞的PBS或HBSS；溶于PBS或其他缓冲体系的4%多聚甲醛固定液；0.1%-0.5% Triton X-100的PBS破膜液；
（二）如需染核，需自备DAPI（2 µg/mL）或PI（1 µg/mL）；
（三）如需阳性对照实验，需自备DNase I（推荐BLGE022）；
（四）如果用流式细胞仪，自备PI染液和RNase A（DNase free）。
实验流程：
（一）样品准备
A.石蜡切片
1.室温下将石蜡组织切片放入二甲苯中浸泡5-10 min，重复2-3次；然后无水乙醇浸泡5 min，重复2次；最后用梯度乙醇（85%、75%、双蒸水）各浸泡1次，每次5 min；
2.用PBS轻轻润洗切片，并去掉样本周围多余液体；使用组化笔沿组织外围轮廓画一个与组织间隔2-3 mm的小圈，便于下游通透性处理和平衡标记操作；在实验过程中，切勿让样品干燥，处理好的样本放在湿盒中保持样本的湿润；
3. 配制Proteinase K工作液：按1：9的比例，用PBS作为稀释液来稀释Proteinase K（200 µg/mL）原液，使其终浓度为20 μg/mL；
4.每个样本上滴加100 μL上述Proteinase K工作液，使其被全部覆盖，37℃孵育20 min；
（注：Proteinase K处理主要有助于组织和细胞后续步骤的染色试剂通透，其孵育时间过长过短都会影响后续标记效率，为得到更好的结果，可以优化Proteinase K孵育的时间）
5.用PBS溶液浸润清洗样本3次，每次5 min（Proteinase K需洗涤干净，否则会干扰后续的标记反应），处理后的样本放在湿盒中保持样本的湿润；
6.（可选步骤）去掉样本上多余的液体，将适量破膜液滴加到组织上，充分浸润组织，室温处理20 min；破膜处理完成后同样的用PBS溶液润洗样本3次，每次5 min；处理后的样本放在湿盒中保持样本的湿润。
B.冰冻切片
1.将玻片浸没在4%多聚甲醛溶液（溶于PBS）中固定，室温下孵育10-15 min；
2.片子从固定液中取出后，通风橱中自然晾干；
3.将玻片放入纯水或PBS中润洗，去掉玻片上残存的固定液；
4.用组化笔沿着组织外围轮廓画一个与组织间隔2-3 mm的小圈，便于下游通透性处理和平衡标记操作；在实验过程中，切勿让样品干燥，处理好的样本放在湿盒中保持样本的湿润；
5.配制Proteinase K工作液：按1：9的比例，用PBS作为稀释液来稀释Proteinase K（200 µg/mL）原液，使其终浓度为20 μg/mL；
6.每个样本上滴加100 μL上述Proteinase K工作液，使其被全部覆盖，室温孵育10 min；
（注：Proteinase K处理主要有助于组织和细胞后续步骤的染色试剂通透，其孵育时间过长过短都会影响后续标记效率，未得到更好的结果，可能需要优化Proteinase K孵育的时间）
7.用PBS溶液润洗样本2-3次，去掉多余液体（Proteinase K需洗涤干净，否则会干扰后续的标记反应），处理后的样本放在湿盒中保持样本的湿润；
8.（可选步骤）将适量破膜液滴加到组织上，充分浸润组织，室温处理20 min，破膜处理完成后同样的用PBS溶液润洗样本，去掉多余液体，处理后的样本放在湿盒中保持样本的湿润。
C.细胞爬片
1.在Lab-Tek载玻片小室（Chamber Slides）上培养贴壁细胞，在凋亡诱导处理之后，用PBS轻轻润洗2遍载玻片；
2.向每个载玻片小室中加入适量的4%多聚甲醛溶液（溶于PBS）固定，室温下孵育20 min；
3.去掉固定液，加入PBS清洗3次，每次5 min；
4.每个样本浸于破膜液中，室温孵育5 min进行通透处理；
5.在盛有PBS溶液的敞口烧杯中浸没清洗样本2-3次；
6.轻轻去掉多余液体，并用滤纸小心吸干载玻片上样本周围的液体。处理后的样本放在湿盒中保持样本的湿润。
D.细胞涂片
1.以约2×107个细胞/mL的浓度将细胞重悬于PBS中，吸取50-100 μL细胞悬液滴于防脱玻片上，使用一片洁净的载玻片轻柔涂开细胞悬液；
2.将玻片浸入装有4%新鲜配制于PBS中的多聚甲醛的染色缸中，固定细胞，在4℃放置25 min；
3.将玻片浸入PBS中，室温放置5 min浸洗，重复一次；
4.轻轻去掉多余液体，并用滤纸小心吸干玻片上样本周围多余的液体，用组化笔沿着细胞外围轮廓画一个小圈，便于下游透性处理和平衡标记操作，在实验过程中，切勿让样品干燥；
5.每个样本浸于破膜液中，室温孵育5 min进行通透处理；
6.在盛有PBS溶液的敞口烧杯中浸没清洗样本2-3次；
7.轻轻去掉多余液体，并用滤纸小心吸干载玻片上样本周围的液体，处理后的样本放在湿盒中保持样本的湿润。
（二）DNase I处理阳性对照实验（可选步骤）
在样本通透处理后，用DNase I（推荐BLGE022）处理样本来准备阳性对照。
1.将100 μL 1×DNase I Buffer（配制方法：取10 μL 10×DNase I Buffer，然后加入90 μL去离子水混匀）滴加到已通透的样本上，室温孵育5 min；
2.轻轻去掉多余液体，加入100 μL含有DNase I（20 U/mL）的工作液（配制方法：取10μL 10×DNase I Buffer，然后加入2 μL DNase I，再加入88 μL去离子水混匀），室温孵育10 min；
3.轻轻去掉多余的液体，并将载玻片在装有PBS的染色缸中彻底洗3-4次。
(注：阳性对照载玻片必须使用单独的染色缸，否则阳性对照载玻片上残留的DNase I可能会在实验载玻片上引入高背景)
（三）标记与检测
1.平衡：每个样本滴加50 μL Equilibration Buffer使其全部覆盖待检样本区域，室温孵育10 min；
2.标记液配制：在冰上解冻FITC-12-dUTP Labeling Mix和Equilibration Buffer，并按照Recombinant TdT enzyme：FITC-12-dUTP Labeling Mix：Equilibration Buffer=1 µL：5 µL：50 µL（1：5：50）比例混合足够用于所有实验的TdT孵育缓冲液，具体实验使用试剂的体积可以根据玻片的大小进行适当等比例调整；
3.阴性对照体系：准备一份不含Recombinant TdT enzyme的对照TdT孵育缓冲液，用ddH2O替代；
4.标记：尽量去掉平衡的Equilibration Buffer，然后在每份组织样本上加入56 μL TdT孵育缓冲液，在37℃孵育1 h；注意不能干片，载玻片要避光；
5.立即用PBS润洗组织样本，清洗4次，每次5 min；
6.用滤纸轻轻擦掉样本周围的PBS溶液；
7.核染色：样本在染色缸中染色，在黑暗中将载玻片浸入装有PI溶液或者DAPI溶液（用PBS新鲜配制并稀释）的染色缸，室温放置8 min；
8.封片：样本染色完成后，用PBS清洗组织样本3次，每次5 min，然后轻轻去掉多余液体，滴加抗荧光淬灭封片剂封片；
9.镜检：立即在荧光显微镜下分析样本，载玻片注意避光，PI/DAPI能将凋亡和未凋亡的细胞都染成红色/蓝色，只在凋亡的细胞核中才有FITC-12-dUTP掺入而定位的绿色荧光。
（四）利用流式细胞术检测悬浮细胞
1.将待检测细胞用PBS清洗两次，4℃离心（500 g）然后重悬在500 µL PBS中；
2.固定：向样品中加入5 mL 1%用PBS配制的多聚甲醛溶液，固定细胞，冰上放置20 min；
3.细胞在4℃，300 g离心10 min，去上清并用5 mL PBS重悬两次，最后用500 µL PBS重悬细胞；
4.通透：向样品中加入5 mL冰上预冷的70%乙醇，-20℃孵育4 h，通透细胞；
（注：细胞也可用破膜液室温5 min进行通透）
5.细胞用300 g离心10 min后用5 mL PBS重悬，再次离心后用1 mL PBS 重悬；
6.平衡：转移约2×106个细胞至1.5 mL的微量离心管，300 g离心10 min，去上清，并用80 μL Equilibration Buffer重悬，室温孵育5 min；
7.标记液配制：在冰上解冻FITC-12-dUTP Labeling Mix和Equilibration Buffer，并按照Recombinant TdT enzyme：FITC-12-dUTP Labeling Mix：Equilibration Buffer=1 µL：5 µL：50 µL（1：5：50）比例混合足够用于所有实验和可选阳性对照反应的TdT孵育缓冲液；
8.标记：细胞用300 g离心10 min，去上清将沉淀重悬在56 μL TdT孵育缓冲液中，37℃孵育1 h，避光。每隔15 min用微量移液器轻轻重悬细胞；
9.反应完成后加入1 mL 20 mM EDTA终止反应，用微量移液器轻柔混匀；
10.300 g离心10 min，去上清并将沉淀重悬在1 mL破膜液中，其中含5 mg/mL BSA，重复洗2次；
11.核染色：300 g离心10 min，去上清并将细胞沉淀重悬在0.5 mL PI溶液中，其中包含250 μg无DNA酶的RNase A，在黑暗中室温孵育细胞30 min；
12.上机检测：流式细胞仪分析细胞，PI能将凋亡和未凋亡的细胞均染成红色，只在凋亡的细胞核中才有FITC-12-dUTP掺入而定位的绿色荧光。
常见问题及处理方案：
（一）出现非特异性荧光标记
1.有些细胞或组织，例如平滑肌细胞或组织，核酸酶或聚合酶的酶活性水平较高，易导致出现非特异性的荧光标记；取细胞或组织后立即固定并且要充分固定，可以阻止这些酶导致假阳性，从而解决该问题；
2.使用了不适当的固定液，例如一些酸性固定液，导致出现假阳性；建议采用推荐的固定液；
3.TUNEL检测反应时间过长，或TUNEL检测反应过程中反应液渗漏，细胞或组织表面不能保持湿润，也可能出现非特异性荧光。注意控制反应时间，并确保TUNEL检测反应液能很好地覆盖样品。
（二）荧光背景很高
1.支原体污染，请使用支原体染色检测试剂盒检测是否为支原体污染；
2.高速分裂和增殖的细胞，有时也会出现细胞核中的DNA断裂；
3.TUNEL反应过强，可以将TdT酶稀释2-5倍后再按照说明书操作，稀释后的TdT酶需当日使用；
4.红细胞中血红蛋白导致的自发荧光产生严重干扰。此时宜选择其它细胞凋亡检测试剂盒。
（三）标记效率低
1.使用乙醇或甲醇固定会导致标记的效率较低；
2.固定时间过长，导致交联程度过高，此时宜减少固定时间；
3.荧光淬灭，荧光在普通光照10分钟就会严重淬灭，解决方法：注意避光操作；
4.碘化丙啶双染时，如果碘化丙啶染色过深会导致观察到的本试剂盒的TUNEL染色效果减弱，碘化丙啶可以接受fluorescein激发产生的荧光，从而起到淬灭作用；解决方法：用较低浓度的碘化丙啶染色，例如0.5μg/ml碘化丙啶可以解决该问题；
5.贴壁细胞如果使用药物诱导凋亡，会使发生凋亡细胞的贴壁性会减弱，所以建议在凋亡诱导结束后，用可以对多孔板进行离心的离心机1000g离心5分钟，然后再吸除培养基并用PBS洗涤；如果没有适合的离心机，请注意操作轻缓，防止发生凋亡的细胞在洗涤时洗去；后续整个操作也需要轻缓。
本产品仅供科研使用，不得用于临床诊断！