产品名称：CuZn/Mn-SOD活性检测试剂盒(WST-8法)
产品编号：BLGE294
产品规格：100T
| 产品组成 | BLGE294-100T |
| SOD检测缓冲液 | 70mL |
| WST-8 | 800μL |
| 酶溶液 | 100μL |
| 反应启动液（40X） | 60μL |
| Cu/Zn-SOD抑制A | 500μL |
| Cu/Zn-SOD抑制B | 500μL |
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说明书 |
产品情况：WST-8的反应产物是稳定的水溶性产物，可以通过单个时间点的吸光度检测来测定SOD活力，适合高通量筛选研究。同时WST-8法测定SOD酶活力时，最大抑制百分率可以接近100%，并且可以不受一些常见的干扰因素的干扰，使检测效果比其它的一些常见方法显著改善。
本试剂盒的检测不受样品中过氧化氢的干扰。很多细胞和组织样品中含有内源性的过氧化氢，会干扰SOD的检测。本试剂盒通过添加适量过氧化氢酶等特殊方法，能有效去除常规样品中过氧化氢的干扰。例如，对于SOD标准品的检测，标准品中添加高达0.1mM的过氧化氢时，对于检测结果仍无显著影响。
本试剂盒可以检测细胞或组织匀浆液上清、全血、红细胞抽提物、血清等生物样品中的SOD活性。一个试剂盒共可以进行100次检测。
注意事项：1.待测样品-70℃可保存1个月。需注意反复冻融会导致SOD部分失活。
2.Cu/Zn-SOD抑制剂A对人体有刺激性，操作时请小心，并注意适当防护以避免直接接触 人体或吸入体内。
3.细胞或组织等样品制备时不能采用含有Triton X-100等去垢剂的溶液，否则会干扰本试 剂盒的检测。
4.抗氧化物会对本试剂盒的检测产生干扰，例如0.1mM ascorbic acid，5mM GSH都会使测 定出来的吸光度显著升高。此时尽管样品没有颜色，如果设置了使用说明中的空白对照3， 就可以消除样品中的抗氧化物的干扰。
5.为了您的健康安全，请穿戴实验服且佩戴一次性手套进行操作。
储存运输：-20℃保存，半年有效。S0103-2 WST-8溶液需避光保存。
产品应用：
1. 样品的准备：
a. 细胞样品的准备：收集细胞，用4℃或冰浴预冷的PBS或生理盐水洗涤1-2遍。沉淀用预冷的PBS在4℃或冰浴进行匀浆(可以使用玻璃匀浆器或各类常见电动匀浆器)。随后匀浆液4℃离心，取上清作为待测样品。
b. 组织样品的准备：动物用生理盐水(0.9% NaCl，含有0.16mg/ml肝素钠)灌流清除血液后获取组织样品。取适量的组织样品，加入4℃或冰浴预冷的PBS在4℃或冰浴进行匀浆(可以使用玻璃匀浆器或各类常见电动匀浆器)。随后匀浆液4℃离心，取上清作为待测样品。
c. 血浆或红细胞样品的准备：用抗凝管收集血液，颠倒混匀。4℃ 600g离心10分钟，移取上清至另一新的1ml离心管中，适量生理盐水稀释后即可作为血浆样本进行检测。红细胞样品可以参考步骤1a细胞样品的制备方法，或其它不含Triton X-100等去垢剂的样品制备方法。
d. 根据蛋白浓度和预计的蛋白使用量，用本试剂盒提供的SOD检测缓冲液适当稀释样品。例如，小鼠肝脏组织10%匀浆液(组 织和匀浆液的重量比为10%)上清，通常需要稀释10-100倍。准备好的样品如果当天测定，可以冰浴保存；如果当天不能 完成测定，可以-70℃冻存，但建议尽量当天完成测定。
e. Cu/Zn-SOD的抑制(测定Mn-SOD或Cu/Zn-SOD时选做)：将Cu/Zn-SOD抑制剂A和经适当稀释的样品或标准品按1:24的体 积比(如4μl +96μl)，在离心管内或96孔板中混合好，37℃孵育1小时；取20微升Cu/Zn-SOD抑制剂B加入到780微升水中， 混匀，即进行40倍稀释。然后将已经40倍稀释的Cu/Zn-SOD抑制剂B和上述混合物再按1:25的体积比混合均匀(如 4μl+100μl)，37℃再孵育15分钟。随后即可进行步骤3a，或暂时4度或冰浴保存。样品处理后宜当日使用，并尽量在处理 后尽快进行后续检测。
注1：稀释后的Cu/Zn-SOD抑制剂B宜当天使用，多余的已稀释的Cu/Zn-SOD抑制剂B可以直接丢 弃。注2：本试剂盒中提供的Cu/Zn-SOD抑制剂A和抑制剂B用于待测样品中Cu/Zn-SOD酶活性的抑制；不宜用于添加到 培养的细胞、组织中，或注射到活体动物中以抑制Cu/Zn-SOD。
2. 试剂盒的准备工作：
a. WST-8/酶工作液的配制：按照每个反应160µl的体积配制适量的WST-8/酶工作液。均匀混合151µl SOD检测缓冲液、8µl WST-8和1µl酶溶液，即可配制成160µl WST-8/酶工作液。根据待检测样品(包括标准品)的数量，配制适量的WST-8/酶工 作液。具体配制方法可以参考下表。配制好的WST-8/酶工作液4℃或冰浴保存，可以在当天使用，但建议尽量现配现用。
| 待测样品数量 | 1 | 10 | 20 | 50 |
| SOD检测缓冲液 | 151 | 1510 | 3020 | 7550 |
| WST-8（μL） | 8 | 80 | 160 | 400 |
| 酶溶液（μL） | 1 | 10 | 20 | 50 |
| WST-8/酶工作液 | 160 | 1600 | 3200 | 8000 |
b. 反应启动工作液的配制：把试剂盒中的反应启动液(40X)融解后混匀，按照每1µl反应启动液(40X)加入39µl SOD检测缓冲 液的比例进行稀释，混匀后即为反应启动工作液。根据待检测样品(包括标准品)的数量，配制适量的反应启动工作液。 配制好的反应启动工作液4℃或冰浴保存，可以在当天使用，但建议尽量现配现用。 c. (可选做)SOD标准品准备：需自备SOD标准品，用本试剂盒提供的稀释液将SOD标准品稀释至如下系列浓度：200U/ml，100U/ml，50U/ml，20U/ml，10U/ml，5U/ml，2U/ml。在随后的检测中可以各取20微升，参考样品进行检测。
说明：为 避免稀释后SOD酶活性的下降，SOD标准品宜现稀释现使用；本试剂盒对于SOD的检测并不需要SOD作为标准品，但可 以使用SOD标准品作为阳性对照或作为对SOD活性定量的参考。
3. 样品测定：
a. 参考下表使用96孔板设置样品孔和各种空白对照孔。并按下表依次加入待测样品和其它各种溶液。加入反应启动工作液 后充分混匀。注意：加入反应启动工作液后反应即会开始，可以在低温操作或用排枪操作以减小各孔间因加入反应启动 工作液的时间先后差异而导致的误差。
| 样品 | 空白对照1 | 空白对照2 | 空白对照3 | |
| 待测样品 | 20μL | - | - | 20μL |
| SOD检测缓冲液 | - | 20μL | 40μL | 20μL |
| WST-8/酶工作液 | 160μL | 160μL | 160μL | 160μL |
| 反应启动液 | 20μL | 20μL | - | - |
b. 37℃孵育30分钟。
说明：孵育25至35分钟检测出来的SOD活力无显著差异，但为保证检测结果的一致性，推荐孵育30分 钟。
c. 在450nm测定吸光度。如无450nm滤光片，可以使用420-480nm的滤光片。可以使用大于600nm的波长作为参考波长进行 双波长测定。
4. 样品中总SOD活力的计算
a. 抑制百分率的计算： 参考如下计算公式计算抑制百分率： 抑制百分率＝[(A空白对照1－A空白对照2)－(A样品－A空白对照3)] / (A空白对照1－A空白对照2) × 100% 如果没有设置空白对照3，则可以把计算公式简化为：抑制百分率 ＝ (A空白对照1－A样品) / (A空白对照1－A空白对照2) × 100% 如果计算出来的抑制百分率小于30%或大于70%，则通常需要把该样品重新测定。尽量使样品的抑制百分率在30-70%范 围内。如果测定出来的抑制百分率偏高，则需适当稀释样品；如果测定出来的抑制百分率偏低，则需重新准备浓度较高 的待测样品。
b. SOD酶活力单位的定义：在上述黄嘌呤氧化酶藕联反应体系中抑制百分率为50%时，反应体系中的SOD酶活力定义为一 个酶活力单位(unit)。
注意：SOD的活力单位的定义方式有很多种，不同的活力单位需根据其定义的不同进行适当换算。
SOD酶活力的计算公式如下：待测样品中SOD酶活力单位＝检测体系中SOD酶活力单位＝抑制百分率 / (1－抑制百分率) units 例如，当抑制百分率为50%时，待测样品中SOD酶活力单位＝50% / (1－50%)units＝1 unit；当抑制百分率为60%时，待 测样品中SOD酶活力单位＝60% / (1－60%)units＝1.5 units。
d. 如果样品为细胞或组织的匀浆液，可以根据样品的蛋白浓度和稀释倍数，将SOD活力单位换算为U/g或U/mg蛋白。如果 样品为红细胞抽提液，可以根据血红蛋白含量，可换算为U/克血红蛋白或U/毫克血红蛋白。 附1：SOD酶活力计算的参考方案：可以先使用本试剂盒绘制SOD标准品的抑制百分率曲线，然后根据样品检测到的抑制百分率对比标准品的抑制百分率曲线计算出样品中的SOD酶活力单位。本方案仅供参考，使用本试剂盒时不必使用本方案 进行检测和计算。此外，本方案需确保标准品的酶活力数据可靠，不会因为标准品的保存问题而导致实际酶活力下降。
附：SOD酶活力的动力学检测：如果条件许可，使用本试剂盒时也可以使用动力学方法检测SOD的酶活力。通常在步骤3a 后可以37℃孵育同时在450nm连续测定吸光度30分钟。根据30分钟内的吸光度变化的斜率计算出抑制百分率：抑制百分率＝[(斜率空白对照1－斜率空白对照2)－(斜率样品－斜率空白对照3)] / (斜率空白对照1－斜率空白对照2)×100%.
其余的计算方法同上述非动力学的计算方法。动力学方法的检测和计算更加精确一些，但检测起来相对要麻烦一些。使用本试剂盒通常使用非动力学方法即可。
本产品仅供科研使用，不得用于临床诊断！