产品名称：ANNEXIN V-FITC/PI凋亡检测试剂盒

产品编号：BLRE067

产品规格：
产品组成 BLCK067-50 BLCK067-100
Annexin V-FITC 250 μL 500 μL
Propidium iodide (PI) 250 μL 500 μL
Binding Buffer (10×) 15 mL 30 mL
说明书 1份 1份

说明书

产品情况：细胞凋亡是发生在胚胎发育和维持组织稳态过程中的正常生理过程，早期改变发生在细胞膜表面，这些细胞膜表面的改变之一是磷脂酰丝氨酸 (Phosphotidylserine，PS) 从细胞膜内转移到细胞膜外，使 PS 暴露在细胞膜外表面。PS 是一种带负电荷的磷脂，正常主要存在于细胞膜的内面，在细胞发生凋亡时细胞膜上的这种磷脂分布的不对称性被破坏而使 PS 暴露在细胞膜外。Annexin V 具有易于结合到磷脂类如 PS 的特性，对 PS 有高度的亲和性。因此，该蛋白可充当一敏感的探针检测暴露在细胞膜表面的 PS。PS 转移到细胞膜外不是凋亡所独特的，也可发生在细胞坏死中。两种细胞死亡方式间的差别是在凋亡的初始阶段细胞膜是完好的，而细胞坏死在其早期阶段细胞膜的完整性就被破坏。因此，可以采用 Annexin V 与 PI 双染的方法，通过流式检测细胞早期凋亡。
本产品通过将Annexin V用FITC进行标记后作为检测探针，检测细胞的早期凋亡。同时以PI区分存活的细胞与坏死、晚期凋亡细胞。Annexin V-FITC和PI结合使用，活细胞呈现阴性染色（Annexin V—/PI—），早期凋亡细胞呈现单荧光阳性（Annexin V+/PI—），而晚期凋亡细胞和坏死细胞呈现双荧光阳性（Annexin V+/PI+）。
本试剂盒适用于流式细胞仪或荧光显微镜检测。

储存运输：2-8℃避光保存，Binding Buffer（10×）长时间储存需置于-20℃；有效期 12个月。

注意事项：
（一）整个实验过程操作应尽量轻柔，避免机械损伤细胞，影响实验结果；
（二）不可省略PBS清洗细胞步骤，同时也要尽可能的去掉残留的PBS；
（三）不能使用含EDTA的胰酶，EDTA会影响Annexin V与PS的结合；
（四）胰酶消化细胞时控制消化时间（消化时间过短，细胞需用力吹打才能脱落，容易造成细胞膜的机械损伤；若消化时间过长，细胞膜同样容易受到损伤，影响检测结果）；
（五）贴壁细胞经凋亡刺激后，如有部分细胞漂浮，需同时收集细胞培养上清液及贴壁细胞合并染色，会使得结果更加准确；
（六）Annexin V-FITC和PI对光敏感，操作时注意避光，且反应结束后尽快进行检测；
（七）实验过程中请穿实验服并戴一次性手套，避免污染，确保安全。

实验流程：
（一）准备细胞样品
1.贴壁细胞：先收集细胞培养液到一离心管内备用。然后用不含 EDTA 的胰酶消化细胞，至细胞可以被轻轻用移液管或枪头吹打下来时，加入前面收集的细胞培养液，吹打下所有的贴壁细胞，并轻轻吹散细胞。再次收集到离心管内。1000rpm 左右离心 5min，沉淀细胞。对于特定的细胞，如果细胞无法完全离心至离心管底，可以适当延长离心时间或稍稍加大离心力。小心吸除上清，可以残留约 50µL 左右的培养液，以避免吸走细胞。加入约 1mL 4℃预冷的 PBS，重悬细胞，再次离心沉淀细胞，小心吸除上清。
2.悬浮细胞：1000rpm 左右离心 5min，沉淀细胞。对于特定的细胞，如果细胞无法完全离心至离心管底，可以适当延长离心时间或稍稍加大离心力。小心吸除上清，可以残留约 50µL 左右的培养液，以避免吸走细胞。加入约 1mL 4℃预冷的 PBS，重悬细胞，再次离心沉淀细胞，小心吸除上清。
（二）实验设计
空白管：阴性对照组细胞，不加 Annexin V/FITC，碘化丙锭溶液(PI)；用于调节电压。
单染管：阳性对照组细胞，只加 Annexin V/FITC；用于调节补偿。
检测管：处理的细胞，加 Annexin V/FITC，碘化丙锭溶液(PI)；用空白管和单染管调节好电压补偿后，获得所需要的流式数据。
（三）用去离子水按1:9稀释 Binding Buffer (2mL 10× Binding Buffer + 18mL去离子水)；
（四）用1×结合缓冲液重新悬浮细胞，调节其浓度为 1~5×106/mL；
（五）取 100µL 的细胞悬液于 5mL 流式管中，加入 5µL Annexin V/FITC 混匀后于室温避光孵育 5 分钟；
（六）加入 5µL 的碘化丙锭溶液 (PI)，并加 400µL PBS，立刻进行流式或荧光显微镜检测。

实验结果分析：
（一）对于流式细胞仪
FITC 最大激发波长为 488 nm，最大发射波长 525 nm，FITC 的绿色荧光在 FL1 通道检测；PI-DNA复合物的最大激发波长为 535 nm，最大发射波长为 615 nm，PI 的红色荧光在 FL2 或 FL3 通道检测。用 flowjo、CellQuest 等软件进行分析，绘制双色散点图，FITC 为横坐标，PI 为纵坐标。典型的实验中，细胞可以分成三个亚群，活细胞仅有很低强度的背景荧光，早期凋亡细胞仅有较强的绿色荧光，晚期凋亡细胞有绿色和红色荧光双重染色。
（二）对于荧光显微镜
1.滴一滴用 Annexin V-FITC/PI 双染的细胞悬液于载玻片上，并用盖玻片盖上细胞；
注意：对于贴壁细胞，可直接用盖玻片培养细胞并诱导细胞凋亡。
2.在荧光显微镜下用双色滤光片观察：Annexin V-FITC 荧光信号呈绿色，PI 荧光信号呈红色。

本产品仅供科研使用，不得用于临床诊断！