噬菌体展示技术筛选纳米抗体
1. 纳米抗体简介
1993年，Hamers-Casterman教授以及他的同事们在骆驼的血清中发现了一种与传统抗体结构不同的新型抗体：缺失轻链的天然重链抗体的可变区组成的单域抗体，该抗体只包含一个重链可变区（VHH）和两个常规的CH2与CH3区，分子量只有15KD，是传统抗体的十分之一左右，是抗原结合片段（scFV，VH-VL）的二分之一左右，因此被称作纳米抗体。
由于没有轻链，纳米抗体仅有3个属于重链的抗原识别区域（CDRs 区）。为了弥补缺少的轻链CDRs的生物学活性，纳米抗体在 CDR3部分增加了氨基酸长度（16~18个氨基酸残基，对应的传统抗体的CDR3有8-15个氨基酸），以增加CDR的多样性和特异性。另外，纳米抗体的 CDR3 区域可形成一个大的暴露的凸环，像“手指”一样延伸到抗原的缝隙或者裂口中，可以接触到传统抗体不能接触的抗原表位。CDR3凸环中的一个半胱氨酸还可以与CDR1 或FR2 的 45 位点的半胱氨酸形成二硫键，可使纳米抗体的生物结构相对稳定，大大降低纳米抗体与抗原结合所需能量，使得高亲和力的纳米抗体的获得较容易。
2. 噬菌体展示原理
将待筛选基因插入噬菌体信号肽序列与主要衣壳蛋白基因VIII或基因III之间，每一个噬菌体只含有一个外源基因，每一个噬菌体只表达一种外源肽或蛋白，且呈现在噬菌体表面，而且不影响噬菌体的完整性。利用展示的多肽与目的蛋白（主要是抗体、抗等）或其他生物大分子亲和的性质可高效率地筛选出特异多肽。亲和筛选的关键在于靶蛋白与短肽间的特异性结合，为了增加筛选的特异性，在筛选的过程中都是不断地降低筛选配基的浓度，从而保证被筛选得到的短肽与靶蛋白有较强的亲和力，即它们的结合是特异性的。
3. 纳米抗体制备方案
纳米抗体的获得现在基本通过免疫羊驼，从羊驼体内自身的抗体成熟阶段来得到抗体基因，通过噬菌体展示筛选技术来从羊驼抗体库中筛选得到高亲和力的抗体序列。整个过程主要包括三个阶段：
羊驼免疫：
一只羊驼可以同时免疫1-5个抗原，每次免疫总的抗原量保持在1-2mg之间，体积在2mL以下，纯化制备的抗原与佐剂进行乳化后对羊驼进行免疫。在每次免疫前进行采血用于免疫评价，采血从羊驼颈部静脉采取。
噬菌体文库构建：
分离免疫后的羊驼外周血单个核细胞，提取总RNA后反转录得到cDNA文库，据设计的引物在cDNA文库中扩增得到VHH片段。通过将抗体基因克隆到相应噬菌体载体上可以将外源基因插入噬菌体基因适当位置并随着随着噬菌体传代，最终使外源蛋白展现在子代噬菌体的表面。
纳米抗体筛选：
筛选的方法主要分为固相筛选和液相筛选两种。通过生物淘洗法、竞争法、消减法、选择性感染筛选、延迟性感染筛选等方法可以对和靶蛋白强力结合的基因片段筛选出来。将靶点抗原或者带有抗原的物质直接/间接的固定在固体载体上，随后加入噬菌体文库和抗原相互作用。作用一段时间后用洗涤液洗涤固体载体表面，可以将未结合或非特异结合的噬菌体洗去。随后用强酸或者强碱破坏固体载体上抗原和阳性噬菌体的结合，从而得到阳性噬菌体溶液。将其侵染大肠杆菌进、铺盘、表达后进行ELISA鉴定，一般重复进行2-3轮的筛选即可获得高亲和力的纳米抗体克隆。