IHC常见问题分析
1. 实验原理
免疫组织化学（Immunohistochemistry，IHC）是利用抗原抗体的特异性结合反应来检测和定位组织和细胞中的某些化学物质的一门技术，它是免疫学和传统组织化学相结合而形成的。带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原(如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等)进行定性、定位、定量测定，免疫组织化学染色技术不仅有较高的敏感性和特异性，其特点是将形态学改变与功能、代谢变化结合起来，直接在组织切片、细胞涂片或培养细胞爬片上定位一些蛋白质和多肽类物质的存在，并可精确到亚细胞结构水平，结合电子计算机图像分析系统或激光扫描共聚集显微术等技术，对被检测物质进行定量分析。
2. 实验步骤
脱蜡与水化——抗原修复——淬灭——封闭——抗体孵育——DAB显色——复染、脱水、透明、封片——镜下观察
3. 常见问题分析
二抗的信号放大：
常用抗体标记法，可分为生物素型和非生物型两种类型。推荐使用非生物素型检测系统。不建议使用生物素型检测系统，原因是操作时间较长，需要进行内源性生物素封闭，但经常会出现阻断不完全的情况，就算阻断完全则需要更长的时间。
组织固定脱水不佳：
可能原因是固定不佳或脱水过度，固定不佳解决方法：溶掉石蜡，二甲苯脱蜡2h——二甲苯2h——无水乙醇1h——80%乙醇1h后转入70%甲醛乙醇固定液重新固定，时间根据组织大小确定。脱水过度解决方法：蜡块粗修后放在冰水中浸泡或用5mmol/L盐酸水浸泡或者用氨水等软化剂软化，再缓慢仔细地切片，切片时刻度比平时薄一些效果可能会更好。
脱片：
注意控制烤片温度与时间，特殊组织需要进行特殊处理，对于脂肪含量丰富的组织必要时先进行脱脂处理，灭活内源性过氧化物酶操作中注意过氧化氢的浓度不宜过高，否则会产生气泡，造成脱片。
切片出现水珠：
可能原因是切片受潮、透明剂与脱水剂互溶不佳或脱水不足，实验过程中注意操作环境，防止切片受潮影响实验结果，检查脱水剂是否失效并及时更换脱水剂。
样本个体差异：
表达量、表达位置的差异，可使用其他实验方法，如WB、Flow等）对样本先进行筛选、设立阳性对照（阳性病例或组织或阳性细胞器）； 样本固定使用中性缓存福尔马林NBF pH7~8为宜，浓度可选择10%，新鲜组织要尽快放入固定液中固定、固定时间48h、为了保证固定彻底，需要对组织进行分割，组织块不能太厚，影响固定效果。
固定剂的选择：
常用的固定剂有中性甲醛液，4%多聚甲醛-磷酸盐缓冲液，标本固定可使细胞内的蛋白质凝固，减少或终止内源性或外源性细胞内分解酶的反应，防止组织细胞自溶，更重要的是保证组织或细胞内的抗原不失去活性。不同的抗原对固定液的耐受程度不同，所以在实验中可根据抗原特性选择合适的固定剂。
抗原修复方法：
常用的修复方法有高压加热修复、微波修复和胰酶修复。其中高压加热修复方法简便，易于操作，效果好，但需要严格把控修复温度和时间，修复结束后让其室温冷却，使蛋白自然复性；抗原修复液需要选择合适的pH，使用时要过量，防止高温条件使得液体蒸干，影响切片效果。
一抗和二抗的浓度和孵育时间：
IHC染色结果受一抗浓度、孵育时间和温度的影响较大，在4℃下，染色反应较慢，背景颜色较浅， 37℃反应较快，时间较短，所以温度过低或过高都会影响实验结果，介于这两者温度之间，可选择室温进行孵育，同时室温条件也适用于较多样本的检测。二抗一般室温孵育时间是30 min。
DAB显色问题：
背景的深浅和特异性染色的深浅都可以由DAB孵育条件决定。DAB显色时间主要由显微镜下控制，当出现特异性染色较强而背景着色较浅时即可冲洗。如果出现DAB显色时间很短颜色深，则需要降低抗体浓度，但也有可能是非特异性蛋白封闭不全，需要延长封闭时间；反之如果DAB显色时间很长才出现阳性染色则可能是一抗体浓度过低或者封闭时间过长。对于较弱的DAB颜色有时可以采取加入金属离子的方法进行增强。
边缘效应：
1.组织边缘与玻片粘贴不牢，边缘组织松脱。解决办法：制备优质的胶片（APES或多聚赖氨酸），组织切片要尽可能切得薄一些，组织前期处理操作要规范，选择较好的组织进行实验。
2.切片上滴加的试剂未覆盖均匀或未覆盖到全部组织，边缘的试剂少，容易变干，导致边缘的试剂浓度比中心区域的高，而使得染色结果偏深。解决办法：滴加试剂时要均匀且充分覆盖到全部组织，为防止边缘水分减少，滴加试剂时可以适当滴加超出组织边缘2mm左右，保证组织部分覆盖均匀。用组化笔画圈时，距组织边缘3-4mm为宜，避免油剂对实验结果的影响。
产生组织切片非特异性染色的原因：
1.抗体浓度高、孵育时间过长会增加背景着色，实验时可缩短一抗或二抗的孵育时间，降低抗体浓度。
2.一抗用多克隆抗体容易出现非特异性着色的问题，所以建议使用单克隆抗体。
3.内源性过氧化物酶和生物素在含血细胞多的组织如肝脏、肾脏等组织中含量很高，防止产生非特异性染色则需要通过延长灭活时间和增加灭活剂浓度来降低背景染色。
4.非特异性组分与抗体结合，可通过延长二抗来源的动物免疫血清封闭时间和适当增加浓度来加强封闭效果。
背景强的原因：
考虑一抗浓度是否过高；调整DAB孵育时间；考虑血清封闭时间是否过短；适当增加抗体孵育后的浸洗次数或者延长浸洗时间等。