Western Blot实验操作指南

一：实验原理

蛋白质免疫印迹（Western Blot，WB )，是将蛋白质通过电泳从凝胶转移到固相支持物NC膜（硝酸纤维素薄膜）或PVDF（聚偏二氟乙烯膜）膜上，然后用特异性抗体检测某特定抗原的技术。
该技术中被检测的特定抗原指目的蛋白。特异性抗体指一抗和二抗，使用“一抗”作为“探针”，标记的二抗用来“显色”。转移蛋白质后的 NC 膜或PVDF膜就称为一个印迹。

二：实验流程

主要包括以下几个步骤：
1. 制胶：按照分子克隆上面的配方，依据实验验证蛋白的分子量大小选择制备相应浓度的SDS-PAGE胶。
2. 上样：小心拔出样品槽梳子，避免撕裂聚丙烯酰胺凝胶加样孔，取出梳子后，以1×SDS电泳缓冲液冲洗加样孔，并以此缓冲液充满之。按照实验需要和顺序上样。
3. 电泳：这个没有具体的时间限制，只要分子量最小的蛋白跑到胶的底部即可。
4. 转膜：根据胶的大小选择合适大小的膜，将电泳分离的条带从凝胶转移至NC/PVDF膜上。常用的方法是电洗脱或电泳转移，形成“负极-海绵-三层滤纸-胶-膜-三层滤纸-海绵-正极”转膜结构， 在施加电场后蛋白质从聚丙烯酰胺凝胶中移出并吸附在膜表面。
5. 封闭：为了防止抗体和膜非特异性结合，加入封闭剂将其他未结合蛋白的区域进行封闭。
6. 抗体孵育：用目标蛋白的抗体（一抗）处理膜，漂洗除去未结合的抗体，膜上仅含有目标蛋白结合的一抗。再用标记的二抗进行酶免疫定位。
7. 显影：显影的方法包括化学发光法以及生色底物显影法。标记HRP（辣根过氧化物酶）的二抗：化学发光底物：一般选用ECL发光法进行实验，ECL中含有H2O2和鲁米诺，在HRP（辣根过氧化物酶）的作用下发出荧光来。 生色底物：HRP的生色底物显影有DAB、4-CN、CN/DAB、AEC和TMB等。标记AP(碱性磷酸酶）的二抗：生色底物：AP的生色底物显影有BCIP、NBT和INT。

三：常见问题分析

    WB实验常会出现实验结果不完美的状况，总结WB可能遇见的问题，分析可能的原因及对应的解决方案，是实验成功的基石。下面我们列举一些常见问题及应用对策。

问题	可能原因	验证或解决办法
阳性条带弱或没有信号	蛋白样本降解	蛋白提取时，保持低温环境并加入相应的蛋白酶抑制剂。蛋白样本建议加入上样缓冲液煮沸变形后保存，避免反复冻存，尽快完成检测。
	抗原量不足	每泳道蛋白上样量不低于20-30μg。
	样本中所含目的蛋白表达量过低或无表达	设置阳性对照，如果阳性对照有结果，则可能是样本中不含目的蛋白或目的蛋白含量太低。可考虑增加样本上样量解决目的蛋白含量低的原因。
	转膜不充分	可以用丽春红染膜幷结合染胶（考马斯蓝）后确定条带是否转移到膜上或转移过度，适当调整转膜的时间和电流。
	试剂之间不匹配	一抗与组织种属，一抗与二抗或/和底物与酶系统之间不匹配。通过设置内参照可以验证二级检测系统的有效性。
	一抗失效	使用新鲜一抗，重复使用有效浓度会降低； 选择在有效期内抗体，幷选择现配现用的工作液。
	抗体孵育不充分	优化抗体孵育量，一抗建议4℃过夜孵育。
	HRP 抑制剂	所用溶液和容器内避免含有叠氮化钠。
	洗膜过度	洗膜时间不宜过长，加入的去垢剂不宜过强或过多，建议使用0.1%的弱去垢剂 Tween-20。
出现多条非特异性条带或条带位置发生错误	细胞传代次数过多	使用原始或传代少的细胞株，或平行实验。
	蛋白样本降解	使用新鲜制备的标本，并使用蛋白酶抑制剂。
	体内表达的蛋白样本具有多种修饰：乙酰化、磷酸化、甲基化、烷基化和糖基化	查文献，使用去修饰的试剂使蛋白恢复其正确的大小。
	蛋白存在二聚体或多聚体	SDS-PAGE电泳上样前，煮沸10min，以增强蛋白质解聚变性。
	抗体不纯	使用单克隆或亲和纯化的抗体，减少非特异条带。
	一抗特异性不高	重新选择或制备高特异性的抗体。
	二抗浓度过高，产生非特性结合	降低抗体浓度，加二抗对照（不加一抗）。
条带背景较高	膜没有均匀浸润	PVDF 膜转膜前用100%甲醇将膜完全浸湿，转膜前用缓冲液浸泡10min且一直保持膜的湿润。
	膜或者缓冲液污染	拿取膜与吸水纸时要戴手套，更换新鲜转膜缓冲液。
	封闭不充分或封闭液不合适	延长封闭时间，考虑更换合适的封闭剂。
	抗体孵育浓度过高，孵育时间过长或温度过高	优化抗体孵育浓度和时间。
	抗体与封闭剂非特异性结合或反应	检测一抗、二抗是否与封闭液反应。
	洗涤不充分	增加洗涤次数。
条带形状不好看	胶凝的不均匀，聚合不好	灌胶前将溶液充分混匀。
	电泳时温度过高	降低电流或电压。
	样品中含有不溶性颗粒	样品充分搅拌混匀。
	电极不平衡或加样位置偏斜	调整电极和加样。