实验室常见问题分析汇总

合成的DNA保存：干燥制品很稳定，-20℃下可保存2年；溶解后的DNA于-20℃保存，最好是分份保存，避免反复冻融；溶液中的Oligo DNA在常温下可放置3～4天。

合成的RNA保存：干燥制品存放于-80℃最好，-20℃下可保存2年；溶液状态的RNA最好保存在-80℃，如无条件，也要保存于-20℃。

对合成DNA/RNA制品进行定量：由于核酸在260 nm附近有强吸收，因此常根据此性质，用紫外分光光度计测定核酸溶液在260 nm的吸光度值，据此对核酸进行定量，用OD值来表示。1个OD值的合成DNA/RNA的质量约为33μg。将DNA/RNA溶液进行适当稀释，使吸光度测定值与样品浓度的关系在直线范围内，再根据原溶液的总体积与稀释倍数计算该溶液的总OD值。

OD260/OD280<1.8：由于核酸在260 nm附近有强吸收，而蛋白质在280 nm附近有强吸收，从生物体内提取核酸时，常用OD260/OD280比值来评价核酸纯度 (比值在1.8～2.0之间)，这一判断是基于序列中A、G、C、T所占比例大致相同时的结果。而合成的DNA/RNA则不同，序列很短 (通常在20～30个碱基之间)，其中A、G、C、T各种碱基所占比例很不相同，由于各种碱基的摩尔消光系数不同，因此不同碱基构成的合成DNA/RNA制品的OD260/OD280比值也不同，例如当序列中C、T碱基的含量高时，该比值会大大低于1.8。此外，序列中碱基的排列顺序也影响该比值。所以不能根据OD260/OD280比值来评价合成DNA/RNA制品的纯度。

引物修饰常见问题分析

引物修饰：常见的引物修饰包括有磷酸化（Phosphorylation）、生物素（Biotin）、地高新（Digoxigenin）、内部氨基修饰、5'氨基修饰、3'氨基修饰、巯基（Thiol）、硫代（Phosphorthioate）、脱氧脲嘧啶（DeoxyUridine，dU）和脱氧次黄嘌呤（deoxyInosine，dI）等。

合成的荧光标记探针保存：荧光探针必须避光保存；干品可于-80℃保存一年以上，无条件时可于-20℃保存；用RNase-free的TE（pH 8.0）buffer溶解探针，得到的探针溶液更稳定，保存时间更长；避免反复冻融。

荧光定量PCR常见问题分析

SYBR-Green染料法与TaqMan荧光探针法：SYBR-Green染料法：染料能够与DNA双链结合，当PCR扩增的时候，染料能特异性地渗入结合到DNA双链上，发射荧光信号，而没有渗入的染料分子不会发射荧光信号，从而通过收集到的荧光信号，确定PCR产物的增加量。染料法特异性不强，只要是双链DNA都可以发光，所以该方法适用于任何DNA，无需设计探针，采取双标准曲线法，实验周期短，结果重复性好，灵敏度高。TaqMan荧光探针法：PCR扩增时需要同时加入一对引物和一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别带上一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号。每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，所以通过荧光信号的累积，可以监测PCR产物形成。探针法设计探针对目标基因有高特异性，实验重复性好，相对于SYBR Green法，灵敏度更高。

荧光定量PCR需要提供的信息：样品（组织/细胞/RNA/cDNA）、物种信息、目的基因的序列、GeneBank编号；引物、内参基因、对照组。

对照组和内参基因：在QPCR中加入内参基因校准，可以消除不同样本在RNA产量、质量以及逆转录上可能存在的差别，从而获得目的基因特异性表达的真正差异。QPCR的实验数据计算的是相对表达量，需以指定的样品（对照组）为标准进行相对定量数据分析。

载体构建常见问题分析

PCR：载体构建大部分时候都要通过PCR的方法获取目的片段，扩增PCR时尽量选用高保真的PCR酶来进行扩增，扩增之前要了解目的基因序列信息，其次高质量的模板对PCR成功与否也很重要，以质粒作为模板的PCR相对来说最好扩增，基因组DNA和cDNA相对来说较难获取一些。

引物：引物设计中，很多软件都可以进行引物设计，比如pirmer5，构建过程中，选用哪种方法需要在引物设计的时候考虑到，一般常用酶切连接的方法，但也可以使用无缝克隆的方法。需要注意的是做酶切连接引物设计要注意加上保护碱基，保护碱基大部分加入4个碱基可以满足大多数内切酶，也可以参照限制性内切酶保护碱基添加表加保护碱基。无缝克隆方法设计引物的时候要加入同源重组臂序列。

菌落PCR鉴定：做菌落PCR鉴定的时候引物一般选择载体上的通用引物来鉴定，因为选用目的片段两端的引物可能会出现假阳性；操作方法一般是在小的EP管培养4小时左右，挑取单克隆，培养基出现浑浊的情况时，即可进行菌落PCR鉴定，鉴定完成后测序验证，PCR过程可能会发生突变，所以多送几个克隆可以保证我们所要的克隆顺利获得。

抗体选择常见问题分析

一抗选择：① 分析自己实验应用的实验方法。根据说明书选择抗体适用的分析类型，如：可以应用于WB、IHC、ICC、ELISA、FCM分析等。 ② 分析自己实验中标本的种属。一般抗体说明书都列出该抗体经试验验证过适用于何种动物或人的标本，如：可以用于rat、mouse、human、pig、goat等动物的标本的实验。 ③ 分析样本中的蛋白质的结构性。抗体是由各种不同免疫原免疫宿主而制备得来，其中的免疫原包括：全长蛋白、蛋白片断、多肽、全有机体（如：细菌）或细胞，抗体说明书一般都有免疫原的描述， 如果打算检测的是蛋白片断或一种特殊的同型物或蛋白全长的某一区域，则必须选择用含此片段域的免疫原制备出的抗体。如果打算用FCM流式检测活细胞的表面蛋白，则需要选择含该表面蛋白的胞外域来免疫制备的抗体。④ 抗体宿主物种的选择。对于免疫组化而言，尽可能选择与样本不同种系物种的一抗，从而避免二抗与样本内源性免疫球蛋白产生交叉反应，例如：检测小鼠样本蛋白，则不应选择小鼠或大鼠源的一抗，最好选兔源的一抗，则二抗则可选择偶联了检测分子（酶、荧光素、生物素等）的抗兔IgG。

二抗选择：① 一抗的种属来源。二抗应选用与使用的一抗相同的物种来源。② 一抗的类别。二抗还需与一抗的类别或亚类相匹配，这通常是针对单克隆抗体而言。③ 二抗的耦联标记。一般来讲，耦联到二抗上的探针主要有酶（辣根过氧化酶HRP和碱性磷酸酶AP或其衍生物APAAP，PAP），荧光基团（FITC, RRX, TR, PE）和生物素。选用哪种探针的二抗主要取决于具体的实验。对于western blot和ELISA，最常用的二抗是酶标二抗，而细胞或组织标记实验（细胞免疫化学，组织免疫化学，流式细胞术）中通常使用荧光基团标记的二抗，免疫组化中也可以使用辣根过氧化酶或碱性磷酸酶标记的二抗。

特殊抗体保存：联抗体酶永远保存在 4℃，避免冷冻；偶联抗体需要在棕色管中或使用锡箔纸避光4℃保存，尤其是荧光抗体，对光极为敏感；IgG3的同型对照，永远保存在4℃，避免冷冻。注意绝对避免反复冻融，反复冻融会导致抗体变性，导致多聚体形成，从而降低抗体的结合能力。

IHC常见问题分析

边缘效应：① 组织边缘与玻片粘贴不牢，边缘组织松脱漂浮在液体中，每次清洗不易将组织下面试剂洗尽所致。解决办法：制备优质的胶片（APES或多聚赖氨酸），切出尽量薄的组织切片，不厚于4微米，组织的前期处理应规范，尽量避免选用坏死较多的组织。 ② 切片上滴加的试剂未充分覆盖组织，边缘的试剂容易首先变干，浓度较中心组织高而致染色深。解决办法：试剂要充分覆盖组织，应超出组织边缘2mm。用组化笔画圈时，为了避免油剂的影响，画圈应距组织边缘3-4mm。

产生组织切片非特异性染色的原因：① 抗体孵育时间过长、抗体浓度高易增加背景着色。这可通过缩短一抗/二抗孵育时间、稀释抗体来控制。② 一抗用多克隆抗体易出现非特异性着色，建议试用单克隆抗体。 ③ 内源性过氧化物酶和生物素在肝脏、肾脏等组织含量很高（含血细胞多的组织），需要通过延长灭活时间和增加灭活剂浓度来降低背景染色。④ 非特异性组分与抗体结合，这需要通过延长二抗来源的动物免疫血清封闭时间和适当增加浓度来加强封闭效果。

背景强的原因：考虑一抗浓度高；调整DAB孵育时间；考虑血清封闭时间是否过短；适当增加抗体孵育后的浸洗次数和延长浸洗时间等。

WB常见问题分析

目的蛋白难显影信号较弱：① 抗体浓度较低，需要增加抗体的浓度，延长孵育时间；② 转膜效率低，转膜缓冲液的pH值若与目的蛋白等电点相近则需要提高pH值；转膜时是否有降温处理；把握好转膜的时间，电压等； ③ ECL量不足或淬灭较快，则要提高ECL的量，并避光孵育膜。

结果背景过高：① 封闭问题：封闭液的浓度不足，提高封闭液的浓度，封闭液需要完全覆盖膜；封闭时间需要1小时以上，或者4℃封闭过夜。② 抗体问题：抗体的非特异性结合，抗体浓度过高，孵育时间过久也会造成如此结果。③ 洗脱问题：提高洗膜次数及时间。所有处理膜的过程中，切勿使膜干掉。④ 显色时化学显色底物过多：按说明书加显色底物。

结果条带出现宽窄不一：① 胶制备的不好，凝胶聚合不均匀：制胶时加入TEMED后，立马混合均匀，尽快灌胶，灌胶时从一角注胶，动作轻缓。 ② 胶板底部确保无气泡，有气泡，需要赶走气。③ 拔梳子时，将孔齿弄歪曲，或孔中残留的胶未冲洗掉，会导致上样带扭曲。④ 电泳液过少，气泡进入上样孔，增加了电阻。⑤ 上样量一定要一致。上样量不宜过大，上样要迅速，否则引起样品扩散，容易导致条带连在一起。

ChIP常见问题分析

碎裂染色质的浓度过低：染色质制备使用的细胞或组织不够，或细胞/组织裂解不完全，如果染色质制备物的 DNA 浓度接近于 50 μg/ml，则向每次 IP 添加额外的染色质，以确保每次 IP 至少产生 5 μg，然后继续实验。交联前，对单独平板上的细胞进行计数，以确定准确的细胞数量。在超声处理前后，用显微镜观察细胞胞核，以确认胞核是否完全裂解。

样品输入对照组 PCR 反应中无产物或产物很少：添加至 PCR 反应的 DNA 不足或条件不是最佳，向 PCR 反应中添加更多 DNA 或增加扩增循环次数。使用来源于交联和碎裂染色质的纯化 DNA 来优化针对实验用引物组的 PCR 条件；添加用于免疫沉淀的染色质不足，或染色质被过度碎裂，建议每次免疫沉淀添加 5–10 μg 染色质。

实验抗体 IP PCR 反应中无产物：添加至 PCR 反应的 DNA 不足，建议向 PCR 反应中添加更多 DNA 或增加扩增循环次数；添加至 IP 反应的抗体不足，建议增加添加至 IP 反应的抗体量。

流式细胞术常见问题分析

荧光信号弱：可能的原因是处理未充分诱导靶标表达，建议对每个靶标进行成功和可测量的诱导，优化处理条件。如果使用的是PBMC，避开冰冻样品，在可能的情况下，分离新鲜细胞。对照选择未刺激/未处理的对照、同型对照、单独细胞（未染色）对照、阳性对照。如果目的靶标为胞内靶标，确保使用合适的固定和通透实验步骤。根据靶标以及是否同时进行表面标记物染色，可能需要不同形式的固定和通透处理。荧光信号弱或者没有荧光信号还要考虑荧光物质的大小、构象和稳定性。

红细胞裂解不完全：可能是0.1% Triton X-100 溶液可能不新鲜，应使用新鲜试剂，并严格遵循流式细胞术实验步骤。

高背景：抗体太多时使用建议的抗体稀释度，使用较低的细胞数时，可自行进行滴定。抗体染色避免使用生物素化抗体。在进行胞内染色时，由于使用链霉亲和素或抗生物素二抗偶联物检测胞内自然存在的内源性生物素，这些很容易导致较高的背景水平。

存在死细胞：在进行活细胞表面染色时，使用活细胞鉴定染料对死细胞设置门控。但对固定细胞完成染色时，使用可固定的活细胞鉴定染料，这种染料能经受固定处理，可在胞内染色时结合使用。