载体构建常见问题分析

一：何为载体

载体（Vector） ，指在基因工程重组DNA技术中将DNA片段（目的基因）转移至受体细胞的一种能自我复制的DNA分子。载体目前有三大类，分别是质粒载体、噬菌体载体与病毒载体。
一个理想的载体至少应具备下列五个条件：
(1)具有对受体细胞的可转移性或亲和性，以提高载体导入受体细胞的效率；
(2)具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点，使得外源基因在受体细胞中稳定遗传；
(3)具有较高的外源DNA的载装能力，以满足长片段的克隆；
(4)具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点，有利于外源基因的拼接插入；
(5)具有合适的选择性标记，便于重组DNA分子的检测。
 

二：实验原理

载体构建（vectorconstruction），为把DNA分子运送到受体细胞中去，必须寻找一种能进入细胞、在装载了外来的DNA片段后仍能照样复制的运载体。理想的运载体是质粒(plasmid)，在基因工程中，常用人工构建的质粒作为载体。载体构建即是构建含外源DNA的质粒。主要包括已有载体多克隆位点MCS的改造和已有载体启动子、增强子、筛选标记等功能元件的改造。载体构建完成后可利用PCR原理进行测序验证。
  

三：实验步骤

四：容易遇到的问题分析

1. 克隆基因的酶切位点：
(1) 对目的基因进行酶切位点扫描分析，选择合适的酶切位点。双酶切时尽量选择酶切温度相同，buffer一致，双酶切效率高的两个内切酶；
(2) 在设计PCR引物时，保护碱基加入的数量要合适，选择切割率高的相应碱基。

2. 目的片段的扩增：
(1) 条带不单一：设计的引物不特异，适当改变引物序列长度；
(2) 无条带：引物设计错误或退火温度不合适；检查引物设计是否合理，是否重新设计；设置问题梯度，选择最合适的退火温度；
(3) 引物形成二聚体：重新设计引物或适当提高退火温度。

3. 载体酶切：
(1) 酶切质粒的纯度与浓度要好；
(2) 如果双酶切的两个酶的最适温度不同，建议单酶切，回收之后再使用另一个酶进行酶切，过夜。

4. 连接片段：
(1) 连接比例：酶切产物回收后，利用琼脂糖凝胶电泳比较载体与目的片段的亮度，确定体积比；
(2) 连接温度和时间：室温条件下2小时，如果后续检测发现阳性克隆较少可选用16℃过夜连接以提高连接成功率；
(3) 对照组与实验组情况相近：载体自连或没完全切开，增加酶量或延长酶切时间、减少所切载体的量、改变连接比等。

5. 菌落提取与PCR：
(1) 多次PCR均无阳性克隆：假阳性过高，可能是由于抗体失效，更换培养皿；
(2) 阳性对照无条带：酶失活或试剂有问题，换新的试剂重新进行PCR；
(3) 阴性对照有条带：引物或试剂被模板污染，将所有试剂换新。

6. 酶切鉴定失败：
(1) 酶失活导致酶切失败，增加阳性对照，确定酶是否成功酶切；
(2) 质粒浓度不够，重新转化到高拷贝的细菌中，再重新提取质粒进行鉴定。

7. 表达鉴定：
(1) 载体质粒为单顺反子，且启动子位于多克隆位点之后。要在扩增目的片段时，引物必须含有起始密码子，否则无法表达相应的蛋白；
(2) 注意细胞系的状态与转染效率，转染效率可以使用带荧光标记的载体检测。